本發(fā)明屬于基因組測(cè)序，尤其涉及一種基于crrna間隔區(qū)裂分進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性識(shí)別的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致人們更加關(guān)注個(gè)體基因變異，尤其是單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphisms,snps)，這些變異約占基因多樣性的90％。單核苷酸多態(tài)性(snps)和插入-刪除標(biāo)記(insertion-deletion?markers,indels)是疾病遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)、藥物基因組學(xué)和生物多樣性研究中廣泛使用的關(guān)鍵遺傳標(biāo)記。值得注意的是，snps與癌癥的發(fā)展有關(guān)，例如braf?v600e突變和egfr?l858r，是一種廣泛應(yīng)用的癌癥診斷和治療生物標(biāo)志物。腫瘤細(xì)胞會(huì)隨著時(shí)間的推移逐漸積累大量的突變，腫瘤祖細(xì)胞迅速增殖，并在多個(gè)基因中發(fā)生snv，盡管只有少數(shù)snv會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成，隨著腫瘤克隆的擴(kuò)張，這些snv幾乎存在于每個(gè)腫瘤細(xì)胞中。因此，檢測(cè)單核苷酸不匹配對(duì)于了解和解決疾病，尤其是癌癥的遺傳易感性至關(guān)重要。

2、在臨床中，常常使用dna雜交探針來(lái)鑒定與疾病相關(guān)的snv，例如taqman探針、分子信標(biāo)、toehold-交換探針和用于擴(kuò)增難突變系統(tǒng)pcr(amplification?refractorymutation?system?pcr,arms-pcr)的引物。taqman?snp?genotyping?assay是一種常用的基于熒光的方法，該方法利用taqman探針的特性，這些探針能夠選擇性地與目標(biāo)snp位點(diǎn)的不同等位基因結(jié)合，當(dāng)pcr擴(kuò)增過(guò)程中，taq?dna聚合酶擴(kuò)增靶標(biāo)dna序列時(shí)，探針會(huì)與其結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度確定樣品中的snp。allele-specific?pcr(as-pcr)利用特異性引物，設(shè)計(jì)成只能與目標(biāo)snp的一種等位基因結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小或通過(guò)其他方法，如凝膠電泳或?qū)崟r(shí)熒光定量pcr，可以確定樣品中的snp型別。pcr反應(yīng)中，只有與引物配對(duì)的目標(biāo)序列才會(huì)被擴(kuò)增，從而可以確定樣本中的snp類(lèi)型。在high-resolution?meltinganalysis(hrm)方法中，pcr擴(kuò)增的目標(biāo)序列經(jīng)過(guò)特定溫度梯度的升溫，導(dǎo)致dna解旋并形成不同的熔解曲線。不同的snp類(lèi)型會(huì)導(dǎo)致不同的熔解曲線模式，因此通過(guò)分析熔解曲線的形狀和峰值來(lái)確定樣本中的snp。sanger測(cè)序作為一種經(jīng)典的dna測(cè)序技術(shù)，使用序列比對(duì)軟件將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為dna序列，通過(guò)比較測(cè)序結(jié)果與參考序列確定樣品中的snp。與傳統(tǒng)的pcr/基因組測(cè)序方法相比，分子反轉(zhuǎn)探針(molecular?inversion?probe,mip)被廣泛用作檢測(cè)snp的替代方法，通過(guò)設(shè)計(jì)兩條獨(dú)立的dna鏈自組裝成啞鈴型dna探針，在存在目標(biāo)序列的情況下，啞鈴探針與目標(biāo)序列進(jìn)行堿基對(duì)雜交，然后一步完成序列特異性缺口填充和連接。采用dna雜交探針和引物進(jìn)行疾病相關(guān)snp檢測(cè)的方法通常設(shè)計(jì)為識(shí)別和標(biāo)記包含目標(biāo)snv的短20～30個(gè)核苷酸序列，對(duì)于檢測(cè)高豐度的snv顯示出較好的表現(xiàn)，但高豐度的wt引起的濃度壓力可能會(huì)輕易地覆蓋由單個(gè)核苷酸突變引入的微妙的自由能差異(1.5kcal/mol至7kcal/mol)，往往難以檢測(cè)突變豐度低于1％的snv，并且核酸靶標(biāo)或引物產(chǎn)物的暴露區(qū)域可能會(huì)通過(guò)不需要的分子內(nèi)或分子間雜交進(jìn)一步降低檢測(cè)靈敏度和特異性?；谀z的低通量方法受繁瑣的操作、分析周期長(zhǎng)的限制，而基于等位基因特異性位點(diǎn)引物延伸、單堿基延伸或目標(biāo)測(cè)序原理的高通量方法極度依賴昂貴的儀器、復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)，并且需要精確的溫控來(lái)排除假陽(yáng)性結(jié)果。tapman探針受特定snp位點(diǎn)的特異性，會(huì)出現(xiàn)某些snp檢測(cè)困難的情況，尤其在復(fù)雜的體系中。hrm產(chǎn)生的溶解曲線復(fù)雜，依賴經(jīng)驗(yàn)豐富的操作者。為了發(fā)展一種低成本、檢測(cè)性能高，不依賴儀器設(shè)備的檢測(cè)方法，crispr/cas系統(tǒng)因固有的自身信號(hào)放大和高特異性識(shí)別能力成為檢測(cè)領(lǐng)域的有利工具，并被廣泛應(yīng)用于snp的檢測(cè)。以crispr/cas12a對(duì)dsdna靶標(biāo)的檢測(cè)為例，當(dāng)錯(cuò)配堿基位于protospacer?adjacent?motif(pam)近端5-10堿基時(shí)，因crrna與dsdna不完全匹配導(dǎo)致cas12a切割能力下降，產(chǎn)出低熒光信號(hào)，以此區(qū)分單堿基錯(cuò)配和野生型靶標(biāo)。盡管pam位點(diǎn)近端的“種子區(qū)域”具有嚴(yán)格的堿基配對(duì)要求，但種子區(qū)域之外對(duì)錯(cuò)配具有一定程度的耐受性，如何更精準(zhǔn)的識(shí)別也成為發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，crispr/cas系統(tǒng)的固有性能越來(lái)越難以應(yīng)對(duì)不同檢測(cè)領(lǐng)域和臨床應(yīng)用。為了解決crispr/cas12a中的脫靶效應(yīng)并增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)dna的識(shí)別，一個(gè)途徑是通過(guò)蛋白工程優(yōu)化cas蛋白，提高其特異性，另一種方法是通過(guò)化學(xué)改變和結(jié)構(gòu)調(diào)整修改crrna，以提高識(shí)別錯(cuò)配堿基的特異性。雖然化學(xué)修飾簡(jiǎn)化了crrna的調(diào)整，但也增加了在各種序列上進(jìn)行crrna設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，并帶來(lái)了更大的生物危險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種基于crrna間隔區(qū)裂分進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性識(shí)別的方法及應(yīng)用。我們開(kāi)發(fā)了一種通用方法增強(qiáng)crispr/cas12a對(duì)單堿基錯(cuò)配的高特異性識(shí)別能力，使得snp的檢測(cè)不受錯(cuò)配堿基位置的限制，并在低突變豐度中仍展示高分辨度，以滿足針對(duì)臨床樣品的實(shí)際檢測(cè)要求。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于crrna間隔區(qū)裂分進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性識(shí)別的方法，通過(guò)將靶標(biāo)的crrna間隔區(qū)進(jìn)行分裂獲得識(shí)別探針，靠近5’端的識(shí)別探針為crrna-forward，靠近3’端的識(shí)別探針為crrna-backward，當(dāng)所述crrna-forward和所述crrna-backward與單堿基錯(cuò)配序列完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，激活cas12a蛋白，產(chǎn)生顯著熒光信號(hào)；當(dāng)所述crrna-forward和所述crrna-backward中存在與間隔區(qū)錯(cuò)配的堿基時(shí)，分裂的crrna間隔區(qū)與不完全匹配序列難以組裝，阻礙cas12a蛋白的激活，不產(chǎn)生熒光信號(hào)。

3、上述的方法，進(jìn)一步的，所述通過(guò)將靶標(biāo)crrna間隔區(qū)進(jìn)行分裂，具體為：將所述靶標(biāo)crrna間隔區(qū)的5’端第6個(gè)堿基至第14個(gè)堿基之間進(jìn)行分裂。這些裂分位置覆蓋了“種子區(qū)域”、“臨近種子區(qū)域”和“遠(yuǎn)離種子區(qū)”。

4、上述的方法，進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)為braf。

5、上述的方法，進(jìn)一步的，將所述braf的crrna間隔區(qū)從5’端第12個(gè)堿基進(jìn)行分裂獲得識(shí)別探針，靠近5’端的識(shí)別探針為12f-braf，靠近3’端的識(shí)別探針為8h-braf，所述12f-braf的dna序列如seq?id?no.1所示；所示8h-braf的dna序列如seq?id?no.2所示。

6、上述的方法，進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)為egfr。

7、上述的方法，進(jìn)一步的，將所述egfr的crrna間隔區(qū)從5’端第6個(gè)堿基進(jìn)行分裂獲得識(shí)別探針，靠近5’端的識(shí)別探針為6f-egfr，靠近3’端的識(shí)別探針為14h-egfr，所述6f-egfr的dna序列如seq?id?no.3所示；所示14h-egfr的dna序列如seq?id?no.4所示。

8、基于一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種所述的方法得到的識(shí)別探針在制備單核苷酸錯(cuò)配的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

9、基于一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種所述的方法得到的識(shí)別探針在制備癌癥檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

10、進(jìn)一步的，檢測(cè)試劑盒包括crrna-forward、crrna-backward和信號(hào)報(bào)告分子。進(jìn)一步的，還包括：depc-treated?water，反應(yīng)緩沖溶液，2μl?500nm?lbcas12。所述信號(hào)報(bào)告分子為熒光團(tuán)淬滅標(biāo)記的dna(fluorophore-quencher?labeled?dna(f-q))。熒光團(tuán)淬滅標(biāo)記的dna序列：5’-bhq1-tcccccct-3’-6-fam)。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

12、(1)本發(fā)明提供了一種基于crrna間隔區(qū)裂分的單核苷酸多態(tài)性識(shí)別探針，首先對(duì)crrna間隔區(qū)的5’端第6個(gè)堿基至第14個(gè)堿基之間進(jìn)行分裂用于crispr/cas12a對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別，分裂組合包括crrna-forward(6-14nt)和crrna-backward(6-14nt)，當(dāng)分裂后的crrna與靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別配對(duì)之后，在熒光值上表現(xiàn)出與完整crrna用于檢測(cè)時(shí)幾乎相同的信號(hào)。和完整crrna相比，本發(fā)明的方法具有三個(gè)優(yōu)勢(shì)，第一、消除高豐度野生型引起的干擾，提高在各種濃度范圍內(nèi)對(duì)低頻snp的優(yōu)越特異性。第二、具有序列普適性，無(wú)需對(duì)crrna進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)修飾和蛋白編輯。第三、對(duì)snp高特異性識(shí)別可耐受序列高gc含量。

13、(2)本發(fā)明提供了一種單核苷酸多態(tài)性識(shí)別探針在snp檢測(cè)中的應(yīng)用，基于crispr/cas12a系統(tǒng)的高效反式切割活性，我們?cè)赾rrna間隔區(qū)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的分裂，結(jié)果證明分裂式間隔區(qū)不會(huì)對(duì)cas12a的激活造成影響，而在檢測(cè)snp的測(cè)試中展現(xiàn)與完整crrna間隔區(qū)相比的顯著優(yōu)勢(shì)?；诋?dāng)前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明的方法優(yōu)點(diǎn)如下：

14、高靈敏性：該方法保持了crispr/cas12a系統(tǒng)在識(shí)別靶標(biāo)dna后對(duì)ssdna的高速翻轉(zhuǎn)切割性能，在信號(hào)傳出中體現(xiàn)其自身信號(hào)放大能力。即使在目標(biāo)snp的含量較低時(shí)，也能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到。

15、高特異性：該方法能夠有效地區(qū)分目標(biāo)snp和野生型序列之間的單堿基差異，和對(duì)照組相比，該方法不受錯(cuò)配位置限制地區(qū)分單堿基錯(cuò)配，在高gc含量位置對(duì)難以進(jìn)行區(qū)分的snp表現(xiàn)高特異性

16、快速反應(yīng)速度：該方法的操作流程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期較短，能夠在短時(shí)間內(nèi)(1小時(shí)內(nèi))完成對(duì)樣品的檢測(cè)和分析。

17、簡(jiǎn)單易行的操作流程和高抗干擾性：該方法不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)條件和專(zhuān)業(yè)技能。并且可適用于血清樣本中的檢測(cè)，在存在高濃度野生型基因序列的情況下能保持穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)體系產(chǎn)生的對(duì)snp檢測(cè)效果顯著，同時(shí)檢測(cè)靈敏度高、特異性好，抗干擾性強(qiáng)，沒(méi)有替代方案。

18、(3)本發(fā)明提供了一種單核苷酸多態(tài)性識(shí)別探針在snp檢測(cè)中的應(yīng)用，用分裂組合針對(duì)靶標(biāo)不同位置的單堿基錯(cuò)配進(jìn)行測(cè)試，并采用crrna-forwad-14nt和crrna-backward-6nt對(duì)pam-遠(yuǎn)端第17nt的單堿基錯(cuò)配通過(guò)混合單堿基突變序列和野生型序列進(jìn)行突變豐度從0.05％-50％的測(cè)試，顯示出低至0.05％的突變豐度的檢測(cè)，在血清中檢測(cè)egfr?l858r和braf?v600e兩種突變基因結(jié)果均顯示100fm-100pm的良好線性關(guān)系，r2＝0.98。