本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥，具體地說(shuō)，涉及高殺線蟲(chóng)活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物寄生線蟲(chóng)每年造成全球糧食減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失巨大?；谥参锛纳€蟲(chóng)大多分布廣、寄主多、致病性強(qiáng)、減產(chǎn)率高、繁殖快、易傳播等特點(diǎn)，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的經(jīng)濟(jì)生態(tài)地位，防治植物寄生線蟲(chóng)被廣泛關(guān)注。

2、目前，防治植物寄生線蟲(chóng)的主要方法是施加化學(xué)藥劑(gamalero?et?al.,2020)。由于化學(xué)殺線藥劑因毒性大、污染環(huán)境、對(duì)人畜健康存在潛在威脅，生物防治作為一種安全有效的手段被廣泛研究和應(yīng)用(diyapoglu?et?al.,2022；ismail,2014)。食線蟲(chóng)真菌憑借突出的線蟲(chóng)防治效果、獨(dú)特的殺線蟲(chóng)方式、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、對(duì)人畜無(wú)害以及持效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注，現(xiàn)已成為生物防治線蟲(chóng)的主要微生物資源，在線蟲(chóng)防治管理中起著至關(guān)重要的作用(tranier,2014)。

3、2011年，luangsa-ard通過(guò)比較分離菌株的18s?rrna、its和tef序列差異，提出一個(gè)新屬，屬名為紫孢菌屬(purpureocillium)，基于醫(yī)學(xué)重要性，將其重新命名為淡紫紫孢菌(purpureocillium?lilacinum)，并指定為紫孢菌屬的模式種(luangsa-ard?et?al.,2011；prasad?et?al.,2015；srilakshmi?et?al.,2017)。紫孢菌屬除包括淡紫紫孢菌外，還有紫色紫孢菌(purpureocillium?lavendulum)(perdomo?et?al.,2013)等5個(gè)種。紫孢菌屬物種不僅具有廣譜ph耐受性，也能在各種基質(zhì)上生長(zhǎng)(cavello?et?al.,2013)。

4、與淡紫紫孢菌相比，紫色紫孢菌在35℃以上不生長(zhǎng)，人畜安全性更高，該真菌作為生物防治劑具有很好的應(yīng)用前景(desaeger,2019)。紫色紫孢菌能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)達(dá)到殺線蟲(chóng)的能力，基于其人畜安全性高，現(xiàn)其代謝物已作為生防植物寄生線蟲(chóng)的活性成分被廣泛研究微生物菌劑防治植物線蟲(chóng)。目前，微生物菌劑防治植物線蟲(chóng)存在防效低和不穩(wěn)定的問(wèn)題，篩選鑒定重要的毒力及調(diào)控基因非常重要，突變體庫(kù)篩選是有效尋找新功能基因的方法。因此，構(gòu)建篩選紫色紫孢菌突變體庫(kù)，挖掘未知基因資源，在防治植物線蟲(chóng)生物制劑的研究中尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服背景技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種高殺線蟲(chóng)活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)對(duì)紫色紫孢菌(purpureocillium?lavendulum)菌株進(jìn)行基因改造，獲得高殺線蟲(chóng)活性的基因工程菌株，具有生長(zhǎng)速率更快和形態(tài)更大等特點(diǎn)，可用于生物線蟲(chóng)防治以及高效生物殺線蟲(chóng)制劑的開(kāi)發(fā)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、高殺線蟲(chóng)活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1，所述工程菌δplgyp1是敲除紫色紫孢菌的plgyp1基因獲得，工程菌δplgyp1的保藏編號(hào)為cgmcc?no.41039。

4、進(jìn)一步地，所述的plgyp1基因的序列如seq?id?no.1所示，plgyp1氨基酸的序列如seq?id?no.2所示。

5、高殺線蟲(chóng)活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

6、1)利用同源重組方法構(gòu)建plgyp1基因敲除載體：以紫色紫孢菌基因組dna為模板，通過(guò)引物gyp15f和gyp15r克隆plgyp1基因5’端同源重組片段，通過(guò)引物gyp13f和gyp13r克隆3’端同源重組片段；

7、2)將供體質(zhì)粒ppk2-sur(氯密磺隆抗性基因)-gfp、限制性內(nèi)切酶xbaⅰ和bglⅱ和plgyp1基因5’端同源重組片段及限制性內(nèi)切酶bsshⅱ和3’端同源重組片段進(jìn)行infusion克隆反應(yīng)得到plgyp1基因敲除載體；

8、3)將plgyp1基因敲除載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中得到含plgyp1基因敲除載體的農(nóng)桿菌；

9、4)將含plgyp1基因敲除載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紫色紫孢菌；

10、5)篩選gyp1轉(zhuǎn)化子，并依次采用驗(yàn)證引物對(duì)y5’f/y5’r、y3’f/y3’r、gyp1-f/gyp1-r和sur-f/sur-r進(jìn)行驗(yàn)證，即得高殺線蟲(chóng)活性紫色紫孢菌的工程菌δplgyp1。

11、進(jìn)一步地，步驟1)中，所述的引物gyp15f和gyp15r用于擴(kuò)增plgyp1基因上游2005bp片段；

12、引物gyp15f的序列為cacgaggacttctagtctagcttgcttctgccttctctgg；

13、引物gyp15r的序列為gcgttggcacagatcagatcttcttgccgctccctgat。

14、進(jìn)一步地，步驟1)中，所述的引物gyp13f和gyp13r用于擴(kuò)增plgyp1基因下游2034bp片段；

15、引物gyp13f的序列為gagagctgatgcgcggcgcgtacgagcactcacgaaatcc；

16、引物gyp13r的序列attcgtcctcgcgcggcgcgaccccaacaccaccaagc。

17、進(jìn)一步地，步驟3)中，將plgyp1基因敲除載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的具體步驟為：

18、a.將農(nóng)桿菌感受態(tài)進(jìn)行冰上融化后，加入10μl構(gòu)建好的plgyp1基因敲除質(zhì)粒并混合均勻，依次進(jìn)行冰浴5min，液氮速凍5min，37℃水浴5min，冰浴5min處理；

19、b.加入800μl無(wú)抗生素的lb液體培養(yǎng)基，置于溫度為28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)2～3h，使農(nóng)桿菌體復(fù)蘇，6000rpm離心1min富集菌體，棄上清液，吹打重懸菌體，在lb+kan平板上涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～72h；

20、c.待單菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落劃線并進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，即得到含有plgyp1基因敲除的農(nóng)桿菌。

21、進(jìn)一步地，步驟4)中，將含plgyp1基因敲除載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紫色紫孢菌的具體步驟為：

22、a.接種含plgyp1基因敲除載體的農(nóng)桿菌于含kan+的lb液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)條件下，180rpm培養(yǎng)至od660＝0.5～0.8；取含農(nóng)桿菌液體lb，其體積＝1.5/所測(cè)od值，將其分裝于ep管內(nèi)，離心富集農(nóng)桿菌菌體；

23、b.在超凈臺(tái)內(nèi)，取兩個(gè)加入葡萄糖和乙酰丁香酮的液體im的錐形瓶，重懸農(nóng)桿菌加入一個(gè)im錐形瓶中，置于28℃條件下，180～220rpm避光誘導(dǎo)至od660≈0.45，未加入重懸農(nóng)桿菌的im錐形瓶作為空白對(duì)照；加熱im培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)避光加入葡萄糖和乙酰丁香酮，倒平板，待其冷卻凝固，避光鋪上滅菌的微孔濾膜，用報(bào)紙避光；

24、c.用b步驟中的對(duì)照組im培養(yǎng)基稀釋紫色紫孢菌孢子濃度至1×105個(gè)/ml，避光操作；待農(nóng)桿菌od660≈0.45后，避光在超凈臺(tái)將農(nóng)桿菌懸液與孢子懸液加入離心管中1:1混勻；取混合液涂于平板上，對(duì)照組涂稀釋后的孢子懸液，倒置于溫度為22℃條件下，避光倒置培養(yǎng)48h；

25、d.加熱后的m-100培養(yǎng)基冷卻至不燙手，在超凈臺(tái)中加入頭孢霉素和sur；將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到含頭孢霉素和sur的m-100培養(yǎng)基上，置于28℃條件下，倒置培養(yǎng)4-5天，直至出現(xiàn)脅迫菌落；

26、e.用加入頭孢霉素和sur的mm固體培養(yǎng)基制斜面；從轉(zhuǎn)膜后的m-100培養(yǎng)基微孔濾膜上，用竹簽挑取脅迫單菌落，在抗性sur斜面上劃線，置于28℃條件下，培養(yǎng)3-4天；長(zhǎng)出的真菌可用液體mm搖菌，收集菌絲后用ctab法提基因組進(jìn)行驗(yàn)證。

27、進(jìn)一步地，步驟5)中，所述的驗(yàn)證引物對(duì)的序列分別為：

28、y5’f序列為cgggaaacgacaatctga；

29、y5’r序列為ccaagtccctccacacaa；

30、y3’f序列為accgctactcacatacacaccag；

31、y3’r序列為gaccccaacaccaccaagc；

32、gyp1-f序列為gcgagggcaagatattacg；

33、gyp1-r序列為gcatcaggaggcagttcat；

34、sur-f序列為cgacgcgatctacaactcgaag；

35、sur-r序列為ttaaccgtgcaggccattcgt。

36、將前述方法構(gòu)建而成的高殺線蟲(chóng)紫色紫孢菌工程菌δplgyp1應(yīng)用在制備線蟲(chóng)生防菌劑中。

37、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過(guò)對(duì)紫色紫孢菌(purpureocillium?lavendulum)菌株進(jìn)行基因改造，利用同源重組方法構(gòu)建plgyp1基因敲除載體，最后獲得高殺線蟲(chóng)活性的基因工程菌株，具有生長(zhǎng)速率更快和形態(tài)更大等特點(diǎn)，在侵染秀麗隱桿線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)以及花生根結(jié)線蟲(chóng)條件下，殺線蟲(chóng)活性比原始菌株分別提高近9倍、2.2倍和1.9倍，可用于生物線蟲(chóng)防治以及高效生物殺線蟲(chóng)制劑的開(kāi)發(fā)。