背景技術(shù)：

1、(地尼白介素-2(denileukin?diftitox))是一種含521個氨基酸的重組dna源性細胞毒性蛋白，由白喉毒素片段a和一部分片段b的氨基酸序列(met1-his388)以及人白介素-2的序列(il-2；ala1-thr133)組成。它當(dāng)前在大腸埃希氏菌(e.coli)表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，并且具有58kd的分子量。新霉素用于發(fā)酵過程中，但在最終產(chǎn)品中不可檢測。以意圖用于靜脈內(nèi)(iv)施用的無菌冷凍溶液形式提供在單次使用小瓶中的在1999年由fda核準用于治療皮膚t細胞淋巴瘤(ctcl)。由于關(guān)于在最終制劑中存在具有異質(zhì)分子量的蛋白質(zhì)聚集物、過量殘余dna和過量殘余清潔劑的擔(dān)憂，fda在2011年6月將置于臨床暫停狀態(tài)。的產(chǎn)生通過在大腸埃希氏菌細胞質(zhì)中表達重組蛋白來實現(xiàn)，而這個表達系統(tǒng)產(chǎn)生形成包含多肽的大型不溶性聚集物或所謂包涵體的重組蛋白。在包括使包涵體形式變性和再折疊的當(dāng)前生產(chǎn)過程中，具有異質(zhì)分子量的蛋白質(zhì)聚集物仍然存在于最終制劑中。在純化形式中存在這些聚集物是使用大腸埃希氏菌源性細胞質(zhì)包涵體作為多肽的來源的結(jié)果，并且是由于即使在吐溫20(tween?20)存在下毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域也具有內(nèi)在疏水性質(zhì)。使用這個方法產(chǎn)生的將在下文中被稱為經(jīng)典或

2、此外，如同所有細菌毒素和植物毒素一樣，攜帶誘發(fā)血管滲漏綜合征(vls)的氨基酸基序。約30％的用治療的患者顯現(xiàn)在伴有快速重量增加的外周水腫至低白蛋白血癥至肺水腫的范圍內(nèi)的vls癥狀。需要的是1)使得能夠以高產(chǎn)率和純度產(chǎn)生ontak樣蛋白、從而消除最終商業(yè)產(chǎn)品中的聚集物的方法，和2)伴有最小vls副作用以向患者提供更安全藥物的經(jīng)修飾的ontak樣蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個實施方案是一種dna表達載體，其包含：toxp；阻斷fe介導(dǎo)的基因表達調(diào)控的突變toxo；和編碼蛋白質(zhì)的dna序列，其中所述toxp和所述突變toxo調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的dna區(qū)段的表達。優(yōu)選的是本發(fā)明的dna表達載體包含編碼信號肽的dna序列，以使從dna表達載體表達出的蛋白質(zhì)連接于通常被裂解去除以形成成熟蛋白質(zhì)的所述信號肽。優(yōu)選突變toxo是seq?idno:1，并且優(yōu)選信號肽是seq?id?no:5。本發(fā)明的dna表達載體可用于產(chǎn)生許多種類的蛋白質(zhì)諸如crm?197和crm?107或其組合。crm蛋白序列以seq?id?no:18-21加以說明。優(yōu)選的是本發(fā)明的dna表達載體編碼白喉毒素或其功能性部分，其連接于受體結(jié)合蛋白或其功能性部分以形成白喉毒素受體融合蛋白。所述融合蛋白的受體結(jié)合蛋白部分可選自包括以下的組：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-15、egf、fgf、p物質(zhì)、cd4、αmsh、grp、tt片段c、gcsf、調(diào)蛋白β1(heregulinβ1)、其功能性部分或其組合。白喉毒素融合蛋白的實例包括以seq?id?no:11-15中的任一者加以說明的蛋白。

2、本發(fā)明的另一實施方案是一種dna表達載體，其包含：toxp；阻斷fe介導(dǎo)的基因表達調(diào)控的突變toxo；編碼蛋白質(zhì)的dna序列，所述蛋白質(zhì)包含信號序列；白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或具有非功能性白喉毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和選自包括以下的組的靶標受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-15、egf、fgf、p物質(zhì)、cd4、αmsh、grp、tt片段c、gcsf、調(diào)蛋白β1、其功能性部分或其組合，其中所述toxp和所述突變toxo調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的所述dna序列的表達。通常，用本發(fā)明的dna表達載體轉(zhuǎn)化的細菌產(chǎn)生連接于信號肽的白喉毒素受體結(jié)合融合蛋白，其由所述信號肽引導(dǎo)至周質(zhì)、培養(yǎng)基或這兩個位置。如果細菌是大腸埃希氏菌，那么信號肽通常將白喉毒素受體結(jié)合融合蛋白引導(dǎo)至周質(zhì)。如果細菌是白喉棒桿菌(corynebacterium?diphtheria)，那么信號肽將白喉毒素受體結(jié)合融合蛋白引導(dǎo)至培養(yǎng)基。優(yōu)選的是本發(fā)明的dna表達載體包含seqid?no:3，并且可包含編碼可裂解蛋白質(zhì)標簽的dna，其中所述可裂解蛋白質(zhì)標簽連接于白喉毒素受體結(jié)合融合蛋白。由本發(fā)明的dna表達載體產(chǎn)生的白喉毒素受體結(jié)合融合蛋白的實例包括seq?idno:11至15中的任一者。

3、本發(fā)明的另一實施方案包括一種用于產(chǎn)生不含聚集物的單體白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步驟：用本發(fā)明的dna表達載體轉(zhuǎn)化細菌；形成轉(zhuǎn)化體；在培養(yǎng)基中孵育所述轉(zhuǎn)化體以使分泌至所述培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)表達；以及從所述培養(yǎng)基純化所述蛋白質(zhì)。用于這個方法中的優(yōu)選細菌是白喉棒桿菌。

4、本發(fā)明的另一實施方案包括一種用于產(chǎn)生不含聚集物的單體白喉毒素融合蛋白的方法，其包括以下步驟：1)用dna載體轉(zhuǎn)化白喉棒桿菌菌株，所述dna載體包含：toxp；阻斷fe介導(dǎo)的基因表達調(diào)控的突變toxo；編碼蛋白質(zhì)的dna序列，所述蛋白質(zhì)包含：信號肽；白喉毒素或其功能性部分，其不含白喉受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或具有非功能性白喉毒素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和選自包括以下的組的靶標受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域：il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-15、egf、fgf、p物質(zhì)、cd4、αmsh、grp、tt片段c、gcsf、調(diào)蛋白β1、tnfα、tgfβ、其功能性部分或其組合，其中所述toxp和所述突變toxo調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的所述dna序列的表達；2)形成轉(zhuǎn)化體；3)在培養(yǎng)基中孵育所述轉(zhuǎn)化體以使所述蛋白質(zhì)表達，并且其分泌至所述培養(yǎng)基中；和4)從所述培養(yǎng)基純化所述白喉毒素融合蛋白。通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的白喉毒素受體融合蛋白的實例包括seqid?no:11至15中的任一者。用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選白喉棒桿菌菌株是棒桿菌c7β(-),tox(-)。

5、本發(fā)明的另一實施方案包括一種治療患有結(jié)核病的患者的方法，其包括以下步驟：制備如本技術(shù)中提供的白喉毒素融合蛋白；向患有結(jié)核病的患者施用所述白喉毒素融合蛋白。

6、本發(fā)明的另一實施方案包括一種包含突變toxo啟動子的dna表達載體。

7、本發(fā)明的另一實施方案包括一種含有本發(fā)明的dna表達載體的白喉棒桿菌菌株。

8、本發(fā)明的另一實施方案是制備蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟：提供dna表達載體，其包含toxp、阻斷fe介導(dǎo)的基因表達調(diào)控的突變toxo、信號序列和編碼蛋白質(zhì)的dna序列；用所述dna載體轉(zhuǎn)化細菌菌株以形成轉(zhuǎn)化體；在培養(yǎng)基中孵育所述轉(zhuǎn)化體持續(xù)一段時期以使分泌至所述培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)表達；以及從所述培養(yǎng)基純化所述蛋白質(zhì)。

9、本發(fā)明的另一實施方案是一種選自seq?id?no:11-15中的任一者的融合蛋白。

10、本發(fā)明的另一實施方案是一種包含上述融合蛋白的藥物組合物。

11、本發(fā)明的另一實施方案是一種藥物組合物，其包含上述融合蛋白和至少一種或多種其他化學(xué)治療劑?；瘜W(xué)治療劑的實例包括異煙肼(isoniazid)、利福平(rifampin)、利福布丁(rifabutin)、利福噴丁(rifapentine)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈霉素(streptomycin)、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素(kanamycin)、乙硫異煙胺(ethionamide)、丙硫異煙胺(protionamide)、特立齊酮(terizidone)、氨硫脲(thiacetazone)、環(huán)絲氨酸(cycloserine)、纏霉素(capreomycin)、對氨基水楊酸(pas)、紫霉素(viomycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、貝達喹啉(bedaquiline)、或迪拉馬尼(delamanid)、利奈唑胺(linezolid)、特地唑胺(tedezolid)、阿莫西林-克拉維酸(amoxicillin-clavulanic?acid)、美羅培南(meropenem)、亞胺培南(imipenem)、克拉霉素(clarithromycin)或氯苯吩嗪(clofazimine)。

12、藥物組合物包含上述融合蛋白和至少一種或多種其他抗微生物劑?？刮⑸飫┑膶嵗ó悷熾?、利福平、利福布丁、利福噴丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星、卡那霉素、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺、特立齊酮、氨硫脲、環(huán)絲氨酸、纏霉素、對氨基水楊酸(pas)、紫霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、貝達喹啉、或迪拉馬尼、利奈唑胺、特地唑胺、阿莫西林-克拉維酸、美羅培南、亞胺培南、克拉霉素或氯苯吩嗪。

13、本發(fā)明的另一實施方案是一種治療或預(yù)防受試者的癌癥的方法，其包括向所述受試者施用有效量的包含選自seq?id?no:11-15中的任一者的融合蛋白的藥物組合物。

14、本發(fā)明的另一實施方案是一種治療或預(yù)防受試者的結(jié)核病的方法，其包括向所述受試者施用有效量的包含選自seq?id?no:11-15中的任一者的融合蛋白的藥物組合物。

15、本發(fā)明的另一實施方案是一種包含本發(fā)明的dna表達載體的原核細胞系。

16、本發(fā)明的另一實施方案是包含本發(fā)明的dna表達載體的試劑盒。

17、本發(fā)明的另一實施方案是一種包含seq?id?no:2的toxp。

18、本發(fā)明的另一實施方案是一種具有seq?id?no:11至15中的任一者的蛋白質(zhì)。