本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，屬于病毒領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)常被用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因遞送，bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)是常用的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)常用于藥物開(kāi)發(fā)、疫苗、免疫活性分子研究等多個(gè)領(lǐng)域。bac-to-bac系統(tǒng)是指從細(xì)菌(bacterium)直到產(chǎn)生桿狀病毒(baculovirus)的一個(gè)完整的生產(chǎn)系統(tǒng)，主要由供體質(zhì)粒(donor)、輔助質(zhì)粒(helper)、桿狀病毒質(zhì)粒(bacmid)以及改造好的大腸桿菌dh10b組成。供體質(zhì)粒在mini-tn7左右同源臂(tn7l和tn7r)之間構(gòu)建有一個(gè)完整的表達(dá)框，可將外源基因插入啟動(dòng)子后的多克隆位點(diǎn)上。輔助質(zhì)粒能編碼轉(zhuǎn)座酶參與tn7轉(zhuǎn)座，幫助外源基因插入bacmid。bacmid中含有經(jīng)過(guò)改造的acmnpv完整基因組、mini-f復(fù)制子和mini-att?tn7靶位點(diǎn)。mini-f復(fù)制子能保證bacmid在大腸桿菌中正常復(fù)制，mini-atttn7靶位點(diǎn)提供轉(zhuǎn)座整合位點(diǎn)。當(dāng)供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含helper和bacmid的大腸桿菌dh10b中后在helper質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶支持下進(jìn)行轉(zhuǎn)座，將供體質(zhì)粒中含有外源基因的表達(dá)框整個(gè)插入到bacmid的靶位點(diǎn)中，從而獲得重組bacmid。重組bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，使目的蛋白得以表達(dá)。

2、λ-red同源重組技術(shù)能夠?qū)U狀病毒基因組內(nèi)基因靶向編輯，該技術(shù)是利用同源重組的方式將待缺失的基因用抗生素抗性基因或其它目的基因替換。pkd46用于表達(dá)red系統(tǒng)的重組酶，它含有λ噬菌體基因的red區(qū)，能夠在l-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下編碼gam、exo、beta這三種蛋白，gam蛋白能抑制進(jìn)入大腸桿菌的線性dna降解，exo核酸外切酶可以沿雙鏈dna末端5’端向3’端降解dna，產(chǎn)生3’突出末端，beta蛋白能結(jié)合單鏈dna3’突出末端，促使外源dna片段與靶基因同源序列發(fā)生配對(duì)。

3、目前，傳統(tǒng)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)胞內(nèi)或胞外蛋白表達(dá)量低，傳代不穩(wěn)定，極晚期大量生產(chǎn)外源蛋白時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始死亡，蛋白高水平表達(dá)時(shí)間短。所以，亟需提供一種可提高外源蛋白表達(dá)量的桿狀病毒表達(dá)載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種可抑制宿主細(xì)胞的凋亡，從而使蛋白持續(xù)表達(dá)的重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種構(gòu)建重組菌dh10b(ac55-61-ko，h)的方法，包括以下步驟：將核苷酸如seq?id?no.1所示的序列轉(zhuǎn)化至含有pkd46質(zhì)粒、acbacmid的bw25113感受態(tài)細(xì)胞，篩選，擴(kuò)搖后，提取bacmid，轉(zhuǎn)化，篩選得到所述重組菌dh10b(ac55-61-ko，h)。

3、其中，所述如seq?id?no.1所示的序列是以pkd3為模板，pcr擴(kuò)增缺失ac55-61的同源片段55r-cat-61f后得到的。

4、本發(fā)明還提供了一株由所述方法構(gòu)建的重組菌dh10b(ac55-61-ko，h)。

5、本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)載體的方法，包括以下步驟：將核苷酸序列如seq?id?no.2所示的重組質(zhì)粒pbd-egfp轉(zhuǎn)化至dh10b(ac55-61-ko，h)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于抗性lb固體培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)，待長(zhǎng)出藍(lán)白斑后，挑取白色單菌落，擴(kuò)搖，獲得重組桿狀病毒表達(dá)載體ac55-61-ko-egfp?bacmid。

6、本發(fā)明還提供了一種由所述方法構(gòu)建得到的重組桿狀病毒表達(dá)載體ac55-61-ko-egfp?bacmid。

7、本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建重組病毒的方法，包括以下步驟：將所述重組桿狀病毒表達(dá)載體ac55-61-ko-egfp?bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，待熒光鋪滿整個(gè)細(xì)胞瓶，收集重組病毒感染細(xì)胞的病變，培養(yǎng)混合上清，獲得重組病毒vacac55-61-ko-egfp。

8、本發(fā)明還提供了一種由所述方法構(gòu)建的重組病毒vacac55-61-ko-egfp。

9、本發(fā)明還提供了一種提高桿狀病毒表達(dá)能力的方法，包括以下步驟：

10、(1)以pkd3為模板，pcr擴(kuò)增缺失ac55-61的同源片段55r-cat-61f，轉(zhuǎn)化至含有pkd46質(zhì)粒、acbacmid的感受態(tài)細(xì)胞中，篩選，擴(kuò)搖后，提取bacmid，轉(zhuǎn)化，篩選得到所述重組細(xì)胞；

11、(2)將t-egfp質(zhì)粒、pfastbacdual質(zhì)粒通過(guò)雙酶切，酶連，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到所述重組質(zhì)粒pbd-egfp；

12、(3)將步驟(2)所述重組質(zhì)粒pbd-egfp轉(zhuǎn)化至步驟(1)所述重組細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得所述重組桿狀病毒表達(dá)載體；

13、(4)用步驟(3)所述重組桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，獲得具有高表達(dá)能力的桿狀病毒。

14、本發(fā)明還提供了一種抑制宿主細(xì)胞凋亡的方法，包括以下步驟：用權(quán)利要求4所述重組桿狀病毒表達(dá)載體ac55-61-ko-egfp?bacmid轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。

15、目前，傳統(tǒng)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)胞內(nèi)或胞外蛋白表達(dá)量低，傳代不穩(wěn)定，極晚期大量生產(chǎn)外源蛋白時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始死亡，蛋白高水平表達(dá)時(shí)間短，這與桿狀病毒中一些非必需基因有關(guān)聯(lián)。如敲除組織蛋白酶(ac127)能夠抑制產(chǎn)生的目的蛋白的降解，提高綠色熒光蛋白的表達(dá)；同時(shí)缺失幾丁質(zhì)酶(ac126)和組織蛋白酶基因，能夠抑制細(xì)胞凋亡，從而延長(zhǎng)蛋白高水平表達(dá)的時(shí)間等。而缺失這些非必需基因可以彌補(bǔ)桿狀病毒表達(dá)量低的不足，本發(fā)明從野生型acmnpv出發(fā)，利用λ-red同源重組技術(shù)缺失ac55-61這幾個(gè)非必需基因，其中ac55-57這三個(gè)基因單獨(dú)缺失acmnpv的突變體能正常表達(dá)蛋白，ac58-60與acmnpv的odv和bv相關(guān)，但它們的缺失不影響目的蛋白的表達(dá)，ac61又稱fp-25，在細(xì)胞核內(nèi)fp缺失的病毒粒子包埋和核衣殼包膜存在缺陷，fp-25在細(xì)胞系中可能具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，推測(cè)這些非必需基因的缺失提高細(xì)胞的生存時(shí)間，提高蛋白的表達(dá)量。為了檢測(cè)缺失型桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量，在構(gòu)建的桿狀病毒表達(dá)載體中插入了綠色熒光蛋白(egfp)基因作為標(biāo)記基因，利用免疫熒光和western?blot來(lái)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了能表達(dá)egfp的野生型桿狀病毒系統(tǒng)作為對(duì)照。通過(guò)分析和比較相同感染復(fù)數(shù)(moi)，不同時(shí)間，ac55-61缺失型和野生型桿狀病毒表達(dá)載體對(duì)外源蛋白的表達(dá)情況來(lái)評(píng)估構(gòu)建的缺失型桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)效果。其中，ac61(fp-25)的缺失能抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)宿主生存時(shí)間，在優(yōu)化桿狀病毒基因組的同時(shí)，以提高蛋白的高水平表達(dá)。egfp作為指示蛋白能夠監(jiān)測(cè)不同時(shí)間段蛋白表達(dá)的情況，有助于比較分析不同表達(dá)載體蛋白表達(dá)的情況，為蛋白表達(dá)的工業(yè)化生產(chǎn)提供有效的方案。

16、本發(fā)明擬構(gòu)建缺失型桿狀病毒表達(dá)載體，首先用λ-red同源重組把a(bǔ)cmnpv中ac55-61這一段非必需基因用氯霉素抗性基因替換，再將缺陷型acmnpv?bacmid轉(zhuǎn)化dh10b(h)，獲得dh10b(55-61-ko，h)；然后將egfp基因片段通過(guò)salⅰ、notⅰ酶連至pfastbacdual中的ph啟動(dòng)子下，構(gòu)建能表達(dá)綠色熒光蛋白(egfp)的穿梭載體pbd-egfp。進(jìn)而將pbd-egfp轉(zhuǎn)化含缺失ac55-61?bacmid的dh10b(55-61-ko，h)感受態(tài)中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，pcr鑒定獲得含egfp的缺失型重組桿狀病毒ac55-61-ko-egfp?bacmid。同時(shí)也構(gòu)建了含egfp的野生型wt-egfpbacmid作為對(duì)照。接下來(lái)利用dotap真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的缺失型和野生型bacmid分別轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，可觀察到綠色熒光，表明熒光標(biāo)記的桿狀病毒載體構(gòu)建成功。收集p1代vacwt-egfp、vac55-61-ko-egfp重組病毒上清，繼續(xù)感染sf9細(xì)胞，獲得p2代病毒上清。最后通過(guò)sds-page和western-blot分析和比較相同感染復(fù)數(shù)(moi)，不同時(shí)間48h、72h、96h、120h，ac55-61缺失型、野生型桿狀病毒中egfp的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)改造后的缺失型桿狀病毒的蛋白表達(dá)能力。

17、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：

18、1、本發(fā)明的缺失型桿狀病毒載體抑制了宿主細(xì)胞的凋亡，從而使蛋白持續(xù)表達(dá)；2、ac55-61缺失型比野生型重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白提高了47％左右，且缺陷型載體比野生型載體延長(zhǎng)蛋白收獲時(shí)間約24小時(shí)；這表明本發(fā)明成功構(gòu)建的缺陷型桿狀病毒表達(dá)載體能夠有效抑制宿主細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)目的蛋白高水平表達(dá)的時(shí)間，從而提高蛋白的表達(dá)量；3、這解決了目前桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量低的缺點(diǎn)，同時(shí)缺失非必需基因，能夠縮短桿狀病毒基因組大小，有利于提高病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。