本發(fā)明涉及植物生物，具體涉及一種植物病毒載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、當(dāng)前由于許多植物中缺乏高效可行的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced?gene?silencing,vigs)技術(shù)成為研究功能基因的重要技術(shù)手段。植物的病毒載體通常分為rna病毒和dna病毒兩類。植物病毒數(shù)量眾多，但僅有極少部分被載體化用于vigs、病毒介導(dǎo)的過表達(dá)(virus-induced?overexpression,vox)等實(shí)驗(yàn)中。以棉花為例，當(dāng)前棉花中報(bào)道的可用于vigs實(shí)驗(yàn)的病毒載體僅有煙草脆裂病毒(tobacco?rattlevirus,trv)和棉花葉皺縮病毒(cotton?leafcrumple?virus,clcrv)兩種。研究表明30℃/26℃的高溫會顯著降低clcrv的積累和vigs沉默效果。trv病毒通常在25℃具有較好的沉默效果。一般情況下，trv的沉默表型在快兩周前后的時(shí)間出現(xiàn)，clcrv通常在兩周后出現(xiàn)。因?yàn)槎鄶?shù)病毒都有特定的宿主范圍，因此挖掘可高效侵染棉花并開發(fā)新的病毒載體工具，將極大豐富棉花的功能基因組學(xué)研究工具。

2、棉花斑點(diǎn)病毒(cotton?chlorotic?spotvirus，ccsv)是2009年在巴西發(fā)現(xiàn)的一種新的雙生病毒，會使棉花產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷的表型。被侵染植株出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)、脈間褪綠和葉片畸變的表型。2013年該病毒的全基因組被測序，其中dna-a包括2,670個堿基，dna-b包括2,650個堿基。(dealmeidamm,jain?s,barroso?pa,hoffmann?lv,de?lucena?mg,resende?rdeo,inoue-nagata?ak.complete?sequence?of?a?new?bipartite?begomovirus?infectingcotton?plants?in?brazil.genome?announc.2013nov?7；1(6):e00661-13.)。此后未有關(guān)于該病毒的更多研究報(bào)告，因此不清楚該病毒是否可以被工程化改造為可用的載體工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種植物病毒載體，通過從頭載體化ccsv病毒，將其開發(fā)為可以用于棉花vigs和vox的新型病毒載體。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種植物病毒載體，所述植物病毒載體的人工合成核苷酸序列如seq?id?no.1所示。該人工合成序列的設(shè)計(jì)方案如下：首先通過ccsv與clcrv病毒基因組的序列比對，注釋了ccsv病毒dna-a和dna-b基因組中潛在的cr區(qū)和其中保守的復(fù)制剪接位點(diǎn)。為了使載體化后的dna病毒入侵植物后能重新環(huán)化，在a和b基因組兩端分別放置了各自的cr區(qū)。為了壓縮整個載體的大小，對cr區(qū)進(jìn)行了部分截短。對于a基因組，刪除了其中的av1蛋白，并替換為包含兩個bsai酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)區(qū)域。將最終設(shè)計(jì)好的序列交由金斯瑞合成并亞克隆到pvs1載體骨架中替換掉clcrv病毒的a和b基因組(申請專利號cn117286178a)，得到植物病毒載體。

4、seq?id?no.1所示，具體如下：

5、gcaaatgatatagtttagtggcatttttgtaaatatgtagaggactccatcttgggactccgtccgtaccaggactctctcaacttctgtgatattttgcggagtcctggagtcccatttatactagaactcccagacccgcggccatcaactataatattactgatggccgcgcgattttggagtccgcctacgtggcgcgatctaggccgtcccccccagttggagtccagacaaggttccgtaaaatgcggcgcgttgtcggatgtagtgtttttatgaccgtatgattcatatttcatgaattacgtggcacatttatatcggcgcgattattttaacgaatttagtttagcgctattttgaaatccgtgaatttgattgagcgcgttttttacgtccgccaatgaaaaacgctctttatggaaataaagttgatgttatatgatacatttatggccattggataatgcctagttaaatctgaataagtttttaaaatttgaagtgtggaaaaattaaatgaccattttcgtaccaatcatatgtcaggtggcagactgtacgaaatatttaatggaccaatgaaatttcatgatgaacgcttataaatcatttaatgcgtcatgattttatatatattgataataatcgcctaattggataatcggataatattggttttcattattcttgaaaatgtatccatctaaatatagaacaggaatgtcaactacttatcggcgaagttctacacggaatcctgtgtacaagcgtgcatatgttgttaaaagaggcaaatggaaacgtggtgttaacaacacaaggaattcacatgatggtgtaaaaatgaaagaacagcgaatgcatgagaatcagtttgggcctgagtttgtaatgggccataacacggcaattgcaacgtatatcaattttcctaatctcgtgaagacggagcccaatcgttcccggtcgtatattaagattaaacgattgagttttaagggaacagttaagattgaccgtgttcctgttgatatgagcattgaaggttctattcctactacagaaggcgttttttctttagtaatcgttgttgatcgcaaacctcacttgaattcatccggaagtctgcatacatttgatgagttgtttggtgcaaggataaacagtcatggtaaattggatattgttcaatctttgaaagaccggttttatataagacatgttcttaaacgtgttttatctgctaataaagatactatgatgatagatcttgaaggaacgatgactctctctaataagcgtaataattgttgggcgacttttaaagatttagataacgaatcatgtaatggtgtttatgcgaatataagcaagaacgccctgttagtctattattgttggatgtcagatgttgtgtctaaagcatctacatttgtatcttatgatcttgattatgttggataaataaaaactttatattacatcaattgagggatttcggctgcgaagggatacagttagtgttaatacactcttgtactgcagtcctaactatattgtctaattgggcttgcgataatgtgatgtttgattgtgtccgttgggccgcaactattgaagcagattctcctgggtctagaactgttgaacccaatctgtttagatctctgtatggatatgacgcttgacctgtttcagaccccacatctgattgggttaatcctatggtgctcctgacagcccatgtatctcctggtctaagctccaatgggctctggaatctcgatgctgatgatgacattgaacggattgtctttctctcccatgtcccgtagccaacgtggtaaaaatcgatgtctttttctgtgaattgttttgacaatatcttcacagttggcgctcgaaatgggatatcaacggaatgttttgccgtagacaacttcagtttacccttaaacttcgcaaaatgggtcatttgatgaacattcgtatcgcaaaccttataaaacaacttccatggaatagggtctttgagggagaaaaatgaagaagagaaaaagtgtagatctatgttacatctgatcgggaaagtccatgacgcttgtaatgattcattgtccgtcatccttctgtcatgaatctccactattactgatcctgtagcgttaatagggacttgttgcctgtattcaatgacgcaatgatcgattttcatacagcttcgacttattctagctgttaattgcgatgctgtagatggaaattgcaagaaaatctcagttaagtcatgagaaagctgatattcatcgcgatgtgattctatataattaaaggcatttgggggattaactaaatgagaatccattaaaaaacacagggtcgcgcagcgagagcgttcaagtgaaaatggagtagaaagcgttcaattgaaaatggaacagagagcgttcaagtgaaagtgattttgaatatgaaaataaaagaaacccacaacttctgaagatgaaaatgattttgaatatagaaaagaaagaaatcagcaattaaagaagataaaagtgattttgaatatagggatattggtttaacagataagaagaaagaattgtgtaataatttaagtaatgtcagcctttaatttatagcaaatgatatagtttagtggcatttttgtaaatatgtagaggactccatcttgggactccgtccgtaccaggactctctcaacttctgtgatattttgcggagtcctggagtcccatttatactagaactcccagacccgcggccatcaactataatattactgatggccgcgcgattttggagtccgcctacgtggcgcgatctaggccgtcccccccagttggagtccagacaaggttccgtaaaatgcggcgcgttgtcggatgtagtgtttttatgaccgtatgattcatatttcatgaattacgtggcacatttatatcggcgcgattattttaacgaatttagtttagcgctattttgaaatccgtgaatttgattgagcgcgttttttacgtccgccaatgaaaaacgctctcctgcaggcatttttgtaaatatatagaggactctttgttgggactccgtccgtaccaggactctctcaacttctgtgatattttgcggagtcctggagtcccatttatactagaactcccagacccgcggccatcaactataatattactgatggccgcgcgattttggagtccgcctacgtggcgcgatctaggccgtccccccagttggagtccagacaaggttccgtaaaatgcggcgcgttgtcgactaaagtggtccagattacagaaacgacaaatttgttaaccaatcaaaatttgtccacgtagcttatttaatttaaacaacttgggcgctaagtttgacacggttatataactggcccattaaagtcttgatggatcaggctttgtttaaagatggcatgcctgcagactagtggagaccgctttactctgatccgcagatatttcatcaggaaagagctttgcaagttccttcattgtagcatcaataatttctgagtcactacatgcaatccattcttctgctggggcaaaaactaactccaacatggattggtttggattgtaatattccttacatgttacagacatgtcagcataaacacttaaaagcgggcttctgctaaagagtagatgatcataggtgttcttcaatttcctatcaaaccagatgtgaacgttgataactggaactccaactaatttctctaatttcttgaagtatgaaatctctctccagtcttcaggcggtctcgattcgctagcgttaactggccagaaccccgtgtatgcaactttgaaaattcgaatctatttttatgattcgatatcaaattaataaagtttaaattttattgaatgattttcaagtacatgactcacatatgatttgtctgttgcaaagcgaacagctcttattacattattaagacaaatgacacctaattgatctagatacatattaactaagaatttaaacctagctaaatatgtcgtcccagaagctgtcattgatttcgtccagacttggaagttcaggaacgccttgtggagatccaatactttcctcaggttgtgattgaaccggatgctgacgtgataaattctggtgttggtgaacggtgggtcttccaccctggttatcttgaaataaaggggattttgcacttcccagataaacacgccattctccgcttgaagtggcgtgatgaattcccctgtgcgtgaatccatgtccctcgcagttgaggtgtatgaagaaggaacaaccacaggctaaatctacacgcttacggcgaatggccctcctcttggcttgcctgtgtctgatcttgatagaggggggagttgaggaagatgaatttagcattgtgaagtgtccaattcttgagagcaacattttcctctttatcgaggaaatctttatagctggacccttcaccaggattgcaaagcacgattgagggaatccctcctttaatttgaacaggctttccgtacttgcaatttgattgccagtctttttgtgcaccaatcaactccttccaatgcttcatcttcagatattgcgggttgatgtcatcgatgacgttatactccgcattgtttgagtaaacccttgaattgaagtccaagtgtccactcaaataattatgtgggcctaaagcacgagcccacattgtcttccccgttcgactatcaccctcgatgattatactaataggacgttccggccgcgcagcgtgatcaactccaaaaaaactatctgcccattcttgcatatcgtctggaacgttgacaaaggaggaaagttgatatggaggaatccatggttccggggcttttttaaagatccgatccaggtttgatcggatgttatgatattgaactatgaacgtttttggatcaccatccttta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6、此外本發(fā)明延續(xù)申請專利號cn117286178a的設(shè)計(jì)思路，將雙組份病毒的兩個基因組置于同一個載體骨架中以避免輔助菌的使用，減少了使用的難度和混菌過程潛在的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。該載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域的接頭序列與另外兩個載體pvs1和pvs2相同(申請專利號cn117286178a)，因此同一個pcr產(chǎn)物可同時(shí)用于構(gòu)建這三種載體的vigs載體。另外將外源基因置于ccsv病毒內(nèi)源基因的編碼框下也可實(shí)現(xiàn)vox。

7、本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

8、本技術(shù)提供的植物病毒載體，是從頭載體化ccsv病毒后設(shè)計(jì)的單一質(zhì)粒系統(tǒng)，簡化了vigs實(shí)驗(yàn)流程，與pvs1和pvs2系統(tǒng)具有相同的接頭序列，便于同時(shí)構(gòu)建單個基因的多種vigs載體。

9、本技術(shù)提供的基于ccsv的vigs系統(tǒng)具有一些明顯有別于clcrv病毒沉默的特點(diǎn)，比如沉默表型注射后一周左右就能觀察到，大田的高溫環(huán)境下沉默區(qū)域比較集中，葉脈和苞葉沉默效果明顯等特點(diǎn)。因此后續(xù)對于植物病毒載體的進(jìn)一步優(yōu)化，將使其可以成為棉花中具有潛在價(jià)值的病毒載體，助力棉花的功能基因組學(xué)發(fā)展。