本技術(shù)屬于生物醫(yī)藥，特別涉及一種具有免疫原性的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽及其制備方法和在制備預(yù)防rsv感染的疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、呼吸道病毒感染是全球最重要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)之一，每年導(dǎo)致全世界數(shù)百萬人住院治療。呼吸道合胞病毒(respiratory?syncytial?virus，rsv)是2歲以下兒童和65歲以上成人急性下呼吸道感染的主要原因。盡管rsv感染引起的呼吸道疾病危害嚴(yán)重，但目前尚無專門針對rsv的有效治療方法和預(yù)防性疫苗?？v觀全球進(jìn)入臨床階段的rsv疫苗，研發(fā)的主要方向集中在減毒活疫苗、重組亞單位疫苗和病毒載體疫苗。rsv疫苗開發(fā)主要針對3種目標(biāo)人群，包括嬰幼兒、孕婦和老年人(≥60歲)。年齡小于6個月的嬰兒，主要通過mabs實現(xiàn)被動免疫保護(hù)，或由孕婦接種rsv疫苗后經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移抗體來獲得被動保護(hù)；對于年齡大于6個月的嬰幼兒則可以通過主動免疫rsv減毒活疫苗來獲得保護(hù)；針對孕婦和老年人，rsv疫苗的開發(fā)以亞單位疫苗為主。

2、主流疫苗抗原的選擇主要集中在f蛋白，尤其是融合前構(gòu)象的f蛋白(pref)。融合前構(gòu)象的f蛋白相比融合后構(gòu)象的f蛋白可以暴露更多具有中和活性的潛在表位，如僅在pref中存在的表位φ和表位v。針對表位φ和表位v產(chǎn)生的抗體具有優(yōu)秀的中和活性，與融合前構(gòu)象的f蛋白結(jié)合后，可以阻斷通過f蛋白構(gòu)象變化介導(dǎo)的病毒膜融合。盡管已有大量關(guān)于rsv?f蛋白融合前構(gòu)象穩(wěn)定性的研究，但其作為疫苗使用的安全性和有效性仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。

3、因此，提供一種安全性高且具有增強的免疫原性和改善的穩(wěn)定性的rsv抗原，以及包含其的疫苗成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種具有免疫原性的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽。

2、一方面，本發(fā)明公開一種重組呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，包含rsv?f蛋白重組胞外域，對應(yīng)于seq?id?no:1所示野生型rsv?f蛋白序列的26-513位氨基酸殘基，其中所述重組胞外域包含至少3類半胱氨酸取代突變，所述半胱氨酸取代突變使得在引入的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，該二硫鍵用于穩(wěn)定蛋白的構(gòu)型或寡聚狀態(tài)，諸如融合前構(gòu)型，其中一類為分子間半胱氨酸取代突變，選自v144c+i407c、k75c+e218c、s146c+n460c和a149c+y458c中的1對或2對。另一類是n類半胱氨酸取代突變，所述n類半胱氨酸取代的位點在野生型rsv?f蛋白氨基酸序列的殘基1-300之間，優(yōu)選的137至216位，包括1對或2對半胱氨酸取代；第三類是c類半胱氨酸取代突變，所述c類半胱氨酸取代的位點在野生型rsv?f蛋白氨基酸序列的殘基320-500之間，優(yōu)選的460至500位，包括1對或2對半胱氨酸取代。

3、本發(fā)明技術(shù)方案中所述n類半胱氨酸取代突變是指其中一對中的一個突變位點在f蛋白的137至216位，c類半胱氨酸取代突變是指其中的一個突變位點在f蛋白的460至500位。

4、本發(fā)明技術(shù)方案中所述一個突變位點在f蛋白的137至216位是指i148c+y286c、s55c+l188c、h159c+i291c或g151c+i288c。

5、本發(fā)明技術(shù)方案中所述一個突變位點在f蛋白的460至500位是指k399c+s485c、s443c+s466c、t323c+i475c、i332c+p480c或f387c+i492c。

6、本發(fā)明公開一種具有免疫原性的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，包含rsv?f蛋白重組胞外域，對應(yīng)于seq?id?no:1所示野生型rsv?f蛋白序列的26-513位氨基酸殘基，其中所述重組胞外域包含如下半胱氨酸取代突變的組合：

7、a、分子間半胱氨酸取代突變選自v144c+i407c、k75c+e218c、s146c+n460c和a149c+y458c中的一對或兩對；

8、b、n類半胱氨酸取代突變，其中的一個突變位點在f蛋白的137至216位；

9、c、c類半胱氨酸取代突變，其中的一個突變位點在f蛋白的460至500位。

10、本發(fā)明技術(shù)方案中所述一個突變位點在f蛋白的137至216位選自i148c+y286c、s55c+l188c、h159c+i291c和g151c+i288c中的一對或兩對；其中所述一個突變位點在f蛋白的460至500位是指k399c+s485c、s443c+s466c、t323c+i475c、i332c+p480c或f387c+i492c。

11、本發(fā)明公開一種重組的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，包含rsv?f蛋白重組胞外域，對應(yīng)于seq?id?no:1所示野生型rsv?f蛋白序列的26-513位氨基酸殘基，相比于野生型rsvf蛋白有半胱氨酸突變k75c+e218c和/或v144c+i407c。

12、本發(fā)明公開一種重組的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，相比于野生型rsv?f蛋白有半胱氨酸突變i148c+y286c或s55c+l188c。

13、本發(fā)明公開一種重組的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，相比于野生型rsv?f蛋白有半胱氨酸突變k399c+s485c或f387c+i492c。

14、本發(fā)明公開所述的多肽，其中所述重組胞外域包含如下半胱氨酸取代突變的組合方案之一：

15、a.v144c+i407c、k75c+e218c、i148c+y286c和f387c+i492c；

16、b.v144c+i407c、i148c+y286c、s55c+l188c和f387c+i492c；

17、c.k75c+e218c、i148c+y286c、t323c+i475c、

18、d.k75c+e218c、i148c+y286c、f387c+i492c、

19、e.k75c+e218c、i148c+y286c、k399c+s485c、

20、f.k75c+e218c、g151c+i288c、k399c+s485c、

21、g.k75c+e218c、h159c+i291c、k399c+s485c、

22、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組胞外域還包含空腔填充突變，所述空腔填充突變位點選自野生型rsv?f蛋白氨基酸序列的67、495、296和190位中的一個、兩個、三個或四個。

23、在一些實施方式中，優(yōu)選的空腔填充突變是n67f，在另一些實施方式中，優(yōu)選的空腔填充突變是n67f+s190v+v296f+v495l。

24、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組胞外域還包含增加表達(dá)量的突變p102a+i379v+m447v、s46g或g184n。

25、本發(fā)明中所述的重組胞外域包含只存在于融合前構(gòu)象中的表位，所述表位包含以seq?id?no:1所示的野生型rsv?f蛋白序列的殘基62-69和196-209。

26、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組胞外域包括至少包含rsv?f蛋白的26-105位氨基酸殘基的重組f2域和至少包含rsv?f蛋白的145-513位氨基酸殘基的重組f1域。

27、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組f2域與重組f1域直接或通過linker連接。

28、在一些實施方式中，其中所述重組f2域與重組f1域通過linker連接是指f2域c端與f1域n端被linker連接，例如將f蛋白重組胞外域的106-144位殘基被選自ggpggs、gapepge或ggsggsg的linker序列取代。

29、在一些實施方式中，其中所述多肽的c端包括多聚化結(jié)構(gòu)域。

30、在一些實施方式中，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域位于所述重組胞外域的c端，與重組胞外域的c端直接相連或通過接頭序列相連。

31、在一些實施方式中，可選地，所述接頭序列為gggssgs、gsgsg或g與s組成的4-10個氨基酸序列。

32、在一些實施方式中，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是三聚化結(jié)構(gòu)域，三聚化結(jié)構(gòu)域促進(jìn)形成3個f1/f2異二聚體的三聚體。

33、在一些實施方案中，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是可實現(xiàn)更多聚的結(jié)構(gòu)域，例如可自組裝形成二十四聚體的鐵蛋白。

34、在一些實施方式中，多聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選foldon結(jié)構(gòu)域或ferritin結(jié)構(gòu)域。

35、在本技術(shù)中，“ferritin”是指粉紋夜蛾鐵蛋白或幽門螺旋桿菌鐵蛋白。在本技術(shù)中，幽門螺旋桿菌鐵蛋白具有單鏈結(jié)構(gòu)。在本技術(shù)中，鐵蛋白可以是粉紋夜蛾或幽門螺旋桿菌鐵蛋白的突變體。在本技術(shù)中，“突變體”通常是指因含有一個或多個差異(突變)而與參比序列不同的序列。該差異可以是取代、缺失或插入一個或多個氨基酸。示例性的，本技術(shù)中使用的ferritin氨基酸序列為esqvrqqfskdiekllneqvnkemqssnlymsmsswcythsldgaglflfdhaaeeyehakkliiflnennvpvqltsisapehkfegltqifqkayeheqhisesinnivdhaikskdhatfnflqwyvaeqheeevlfkdildkielignenhglyladqyvkgiaksrks。

36、在一些實施方式中，其中所述重組胞外域包括rsv?f蛋白的f2域或其功能活性片段以及f1域或其功能活性片段。

37、在一些實施方式中，所述f2域包含與seq?id?no:1的氨基酸26-105對應(yīng)的rsv?f蛋白多肽，所述f1域包含與seq?id?no:1的氨基酸137-516對應(yīng)的rsv?f蛋白多肽。

38、在一些實施方式中，其中所述重組胞外域包括至少包含rsv?f蛋白的26-105位氨基酸殘基的重組f2域和至少包含rsv?f蛋白的145-513位氨基酸殘基的重組f1域。

39、在一些實施方式中，其中所述重組胞外域包括包含rsv?f蛋白的26-105位氨基酸殘基的重組f2域和包含rsv?f蛋白的145-513位氨基酸殘基的重組f1域。

40、在一些實施方式中，其中所述重組f2域和重組f1域之間通過接頭序列相連。

41、在一些實施方式中，其中所述重組f2域和重組f1域之間通過gggssgs、gsgsg、ggpg或g與s組成的4-10個氨基酸殘基的接頭序列相連。

42、在一些實施方式中，其中所述g與s組成的4-10個氨基酸殘基的接頭序列，可選的為ggsggsg。

43、在一些實施方式中，其中所述重組胞外域包括至少包含rsv?f蛋白的26-103位氨基酸殘基的重組f2域和至少包含rsv?f蛋白的146-513位氨基酸殘基的重組f1域。

44、在一些實施方式中，其中所述重組胞外域包括包含rsv?f蛋白的26-103位氨基酸殘基的重組f2域和包含rsv?f蛋白的145-513位氨基酸殘基的重組f1域。

45、在一些實施方式中，其中所述重組胞外域包括包含rsv?f蛋白的26-103位氨基酸殘基的重組f2域和包含rsv?f蛋白的147-513位氨基酸殘基的重組f1域。

46、在一些實施方式中，其中所述重組f2域和重組f1域之間通過由甘氨酸g、脯氨酸p以及選自絲氨酸s、丙氨酸a、谷氨酸e和賴氨酸k中一種或多種氨基酸組成的5-8個氨基酸殘基的接頭序列連接。

47、在一些實施方式中，其中所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p和絲氨酸s組成的5-8個氨基酸殘基的接頭序列。

48、在一些實施方式中，所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p和絲氨酸s組成的6個氨基酸殘基長度的接頭序列，其中所述接頭序列為ggpggs。

49、在一些實施方式中，其中所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p、絲氨酸s和丙氨酸a組成的5-8個氨基酸殘基的接頭序列。

50、在一些實施方式中，所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p、絲氨酸s和丙氨酸a組成的5個氨基酸殘基長度的接頭序列，其中所述接頭序列為gapgs。

51、在一些實施方式中，其中所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p、丙氨酸a和谷氨酸e組成的5-8個氨基酸殘基的接頭序列。

52、在一些實施方式中，所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p、丙氨酸a和谷氨酸e組成的7個氨基酸殘基長度的接頭序列，其中所述接頭序列為gapepge。

53、在一些實施方式中，其中所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p、丙氨酸a、谷氨酸e和賴氨酸k組成的5-8個氨基酸殘基的接頭序列。

54、在一些實施方式中，所述接頭序列是由甘氨酸g、脯氨酸p、丙氨酸a、谷氨酸e和賴氨酸k組成的7個氨基酸殘基長度的接頭序列，其中所述接頭序列為gkpapge。

55、在一些實施方式中，其中所述空腔填充突變選自n67f，s190v，v296f和v495l中的一種或多種。在一些實施方式中，其中所述空腔填充突變?yōu)閚67f。在一些實施方式中，其中所述空腔填充突變優(yōu)選為n67f，s190v，v296f和v495l的組合。

56、在一些實施方式中，其中所述增加表達(dá)量的取代選自p102a+i379v+m447v、s46g、l95m、i221m和/或e218a。在一些實施方式中，其中所述靜電突變選自g184n、同時在另一些實施方式中，g184n也有增加表達(dá)的作用。

57、在一些實施方式中本發(fā)明設(shè)計了分子間二硫鍵，是指單體與單體之間相連接的二硫鍵，可以協(xié)助將f蛋白鎖定在融合前構(gòu)象，例如k75c+e218c、k75c+e218c、v144c+i407c或s150c+y458c等。在一些實施方式中本發(fā)明設(shè)計了固定膜遠(yuǎn)端區(qū)域的二硫鍵突變n類二硫鍵，是指二硫鍵突變的其中一個突變位點在f蛋白的137至216位，例如i148c+y286c、s55c+l188c、h159c+i291c或g151c+i288c。在一些實施方式中本發(fā)明設(shè)計了固定膜近端區(qū)域的二硫鍵突變c類二硫鍵，是指二硫鍵突變的其中一個突變位點在f蛋白的460至500位，例如k399c+s485c、s443c+s466c、t323c+i475c、i332c+p480c或f387c+i492c。

58、在一些實施方式中，其中所述增加表達(dá)量的突變包括s46g。

59、在一些實施方式中，其中所述增加表達(dá)量的突變包括g184n、s46g、l95m、和i221m。

60、本發(fā)明公開的多肽包含表達(dá)所需要的信號肽序列或者與純化標(biāo)簽相連接的接頭序列，這些信號肽序列或者與純化標(biāo)簽相連接的接頭序列可以在最終產(chǎn)物中除去。

61、在一些實施方式中，所述多肽在構(gòu)建時進(jìn)一步包含異源信號肽。

62、在一些實施方式中，所述異源信號肽是igg信號肽，氨基酸序列為mgwsciilflvatatgvhs。

63、在一些實施方式中，所述多肽在載體構(gòu)建時還引入了便于后續(xù)純化的親和標(biāo)簽，如strep?tag(氨基酸序列：wshpqfek)、monoclonal?flag-tag(氨基酸序列：dykddddk)和his?tag(氨基酸序列：hhhhhhhh)，這些標(biāo)簽序列可以在最終產(chǎn)物中除去。

64、本發(fā)明還提供所述的多肽在制備預(yù)防rsv感染的疫苗中的應(yīng)用。

65、本發(fā)明還提供一種預(yù)防rsv感染的疫苗，包含上述任一種的多肽；所述疫苗針對rsv?a亞型和/或b亞型中的至少一種感染提供保護(hù)。

66、本發(fā)明公開一種預(yù)防rsv感染的疫苗組合物，進(jìn)一步包含免疫佐劑，所述免疫佐劑包含鋁佐劑、角鯊烯、生育酚、mpl、lpa、cpg、poly(i:c)以及qs-21中的至少一種。

67、在一些實施方式中，本發(fā)明公開預(yù)防rsv感染的疫苗，包含脂質(zhì)體形式的佐劑，脂質(zhì)體形式的佐劑的主要成分包括mpl、qs-21、dopc和膽固醇。佐劑的劑量可以是每劑為0.5ml，含50μg?mpl、50μg?qs-21、1mg?dopc、0.25mg膽固醇、4.835mg氯化鈉、0.15mg無水磷酸氫二鈉、0.54mg磷酸二氫鉀和注射用水，也可以是上述劑量的二分之一、四分之一或更少，例如主要成分包括25μg?mpl、25μgqs-21、0.5mg?dopc、0.125mg膽固醇。

68、rsv病毒有a和b兩個亞型，并且每個亞型下面有不同的基因型。a型在人群中更為普遍，而b型則更容易引起嬰幼兒的下呼吸道感染。兩種亞型之間存在少量抗原差異性。本發(fā)明技術(shù)方案還包括提供一種呼吸道胞合病毒抗原組合物，其特征在于，所述呼吸道胞合病毒抗原組合物包含第一組分和第二組分，所述第一組分源自呼吸道胞合病毒第一毒株的f蛋白，所述第二組分蛋白源自呼吸道胞合病毒第二毒株的f蛋白，也可以包括第三毒株或第四毒株。

69、在一個具體的實施例中，本發(fā)明rsv抗原組合物包括a亞型或/和b亞型的重組呼吸道合胞病毒(rsv)多肽。

70、本發(fā)明公開一種重組的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，包含a亞型或/和b亞型的rsvf蛋白重組胞外域，對應(yīng)于seq?id?no:1所示野生型rsv?f蛋白序列的26-513位氨基酸殘基，相比于野生型rsv?f蛋白有半胱氨酸突變k75c+e218c或v144c+i407c。

71、本發(fā)明公開一種重組的a亞型或/和b亞型的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，相比于野生型rsv?f蛋白有半胱氨酸突變i148c+y286c或s55c+l188c。

72、本發(fā)明公開一種重組的a亞型或/和b亞型的呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，相比于野生型rsv?f蛋白有半胱氨酸突變k399c+s485c或f387c+i492c。

73、本發(fā)明公開所述的多肽，其中所述重組的a亞型或/和b亞型的胞外域包含如下半胱氨酸取代突變的組合方案之一：

74、a.v144c+i407c、k75c+e218c、i148c+y286c和f387c+i492c；

75、b.v144c+i407c、i148c+y286c、s55c+l188c和f387c+i492c；

76、c.k75c+e218c、i148c+y286c、t323c+i475c；

77、d.k75c+e218c、i148c+y286c、f387c+i492c；

78、e.k75c+e218c、i148c+y286c、k399c+s485c；

79、f.k75c+e218c、g151c+i288c、k399c+s485c；

80、g.k75c+e218c、h159c+i291c、k399c+s485c。

81、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組a亞型或/和b亞型的rsv胞外域還包含空腔填充突變，所述空腔突變位點選自野生型rsv?f蛋白氨基酸序列的67、495、296和190位中的一個、兩個、三個或四個。

82、在一些實施方式中，優(yōu)選的空腔填充突變是n67f，在另一些實施方式中，優(yōu)選的空腔填充突變是n67f+s190v+v296f+v495l。

83、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述a亞型或/和b亞型的重組胞外域還包含增加表達(dá)量的突變p102a+i379v+m447v、s46g或g184n。

84、本發(fā)明中所述的重組a亞型或/和b亞型的胞外域包含只存在于融合前構(gòu)象中的表位，所述表位包含以seq?id?no:1所示的野生型rsv?f蛋白序列的殘基62-69和196-209。

85、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組a亞型或/和b亞型的胞外域包括至少包含rsv?f蛋白的26-105位氨基酸殘基的重組f2域和至少包含rsv?f蛋白的145-513位氨基酸殘基的重組f1域。

86、本發(fā)明技術(shù)方案中所述的多肽，其中所述重組f2域與重組f1域直接或通過linker連接。

87、在一些實施方式中，其中所述重組f2域與重組f1域通過linker連接是指f2域c端與f1域n端被linker連接，例如將a亞型或/和b亞型的f蛋白重組胞外域的106-144位殘基被選自ggpggs、gapepge或ggsggsg的linker序列取代。

88、在一些實施方式中，其中所述a亞型或/和b亞型的重組多肽的c端包括多聚化結(jié)構(gòu)域。

89、在一些實施方式中，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域位于所述重組胞外域的c端，與重組a亞型或/和b亞型的f蛋白胞外域的c端直接相連或通過接頭序列相連。

90、在一些實施方式中，可選地，所述接頭序列為gggssgs、gsgsg或g與s組成的4-10個氨基酸序列。

91、在一些實施方式中，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是三聚化結(jié)構(gòu)域，三聚化結(jié)構(gòu)域促進(jìn)形成3個f1/f2異二聚體的三聚體。

92、在一些實施方案中，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域是可實現(xiàn)更多聚的結(jié)構(gòu)域，例如可自組裝形成二十四聚體的鐵蛋白。

93、在一些實施方式中，多聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選foldon結(jié)構(gòu)域或ferritin結(jié)構(gòu)域。

94、在本技術(shù)中，免疫原性組合物抗原劑量60-120μg，在一個具體的實施例抗原為a型融合前f蛋白，或b型融合前f蛋白，在一個具體實施方式中抗原為本發(fā)明所設(shè)計的a亞型抗原，也可以是b亞型抗原，或者其中已經(jīng)公開或未知的rsvf蛋白的亞型。抗原劑量為7.5μg、30μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg、150μg，抗原優(yōu)選劑量60-120μg。

95、本發(fā)明技術(shù)方案還包括提供呼吸道胞合病毒抗原組合物，所述第一組分和所述第二組分的重量比為(1-4)：(1-4)，優(yōu)選為1：1。每一組分包含f蛋白7.5-80μg，優(yōu)選30-60μg。在一個合適的實施方式中，抗原包含a型抗原與b型抗原的混合物，每一亞型的抗原7.5μg、30μg、50μg、60μg、70μg或80μg。

96、本發(fā)明技術(shù)方案還包括提供一種呼吸道胞合病毒免疫組合物，其特征在于，包含佐劑和源自至少一種呼吸道胞合病毒毒株的抗原，所述抗原包含a亞型或/和b亞型的重組呼吸道合胞病毒(rsv)多肽，所述佐劑選自水包油乳液佐劑或脂質(zhì)體佐劑。

97、本發(fā)明技術(shù)方案還包括提供所述水包油乳液的油相為角鯊烯和α-生育酚，乳化劑為吐溫80。

98、在一個具體的實施方式中，所述水包油乳液包含0.1～25wt.％的角鯊烯、0.1～25wt.％的α-生育酚和0.05～6wt.％的吐溫80。

99、在一個具體的實施方式中，每劑疫苗包含角鯊烯0.5～18mg、生育酚0.5～18mg、吐溫0.2～6mg；優(yōu)選地，每劑疫苗包含角鯊烯5～15mg、生育酚5～15mg、吐溫2～5.5mg；在一個具體的實施方式中，更優(yōu)選地，每劑疫苗包含角鯊烯9～13mg、生育酚9～13mg、吐溫4～5mg，在一個具體的實施例中包含角鯊烯10.69mg、α-生育酚11.86mg、吐溫80?4.86mg，在一個具體的實施例中包含包含角鯊烯5.35mg、α-生育酚5.93mg、吐溫80?2.43mg、

100、在一個具體的實施方式中，所述一人份標(biāo)準(zhǔn)劑量乳劑包含角鯊烯10.69mg、α-生育酚11.86mg、吐溫80?4.86mg、氯化鈉3.53mg、氯化鉀0.09mg、磷酸氫二鈉0.51mg、磷酸二氫鉀0.09mg。每劑疫苗中包含的乳劑劑量為所述一人份標(biāo)準(zhǔn)劑量乳劑的1/2或1/4。

101、本發(fā)明還提供制備所述多肽的方法，包括如下步驟：

102、s1、合成所述多肽對應(yīng)的dna序列，并克隆到質(zhì)粒載體中；

103、s2、用重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、并進(jìn)行表達(dá)，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞；

104、s3、對培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到所述多肽。

105、在一些實施方式中，本發(fā)明所述疫苗通常還包含藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑諸如緩沖劑。藥學(xué)可接受載體和賦形劑是公知的，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇。任選地，藥學(xué)可接受載體或賦形劑還含有至少一種穩(wěn)定溶解度和/或穩(wěn)定性的成分。增溶劑/穩(wěn)定劑的例子包括去污劑，例如月桂樹肌氨酸和/或吐溫。另有一些增溶劑/穩(wěn)定劑的例子包括精氨酸、蔗糖、海藻糖等。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的賦形劑和載體以產(chǎn)生適合于通過選定的使用途徑向受試者施用的配制劑。合適的賦形劑包括但不限于甘油、聚乙二醇、kcl、鈣離子、鎂離子、錳離子、鋅離子和其他二價陽離子相關(guān)鹽等。

106、通常在佐劑選擇時應(yīng)能夠在接受疫苗施用的受試者或受試者群體中增強th1偏向性免疫應(yīng)答，且在受試者或受試者群體中是安全且有效的。

107、本發(fā)明還提供制備上述預(yù)防rsv感染的疫苗的方法，其包括：

108、s1、培養(yǎng)哺乳動物宿主細(xì)胞以表達(dá)所述多肽；

109、s2、純化經(jīng)步驟(1)表達(dá)的多肽；

110、s3、將純化的多肽與免疫佐劑按比例充分混合。

111、在一些實施方式中，還包括基因合成、表達(dá)載體的構(gòu)建、純化蛋白的凍干等額外步驟。可以通過本領(lǐng)域公知的許多方法的任一種或幾種來從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化所表達(dá)的融合多肽，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、過濾、超濾、離心、陰/陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最后，可以在最終的純化步驟中采用高效液相層析hplc。

112、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

113、本發(fā)明通過對野生型rsv?f蛋白進(jìn)行穩(wěn)定化修飾和多聚化(例如三聚化)等設(shè)計，獲得了表達(dá)量高，且能夠保留對pre-f具有特異性表位的具有免疫原性的rsv多肽，在維持穩(wěn)定的融合前構(gòu)象的同時確保了其可引起對呼吸道合胞病毒的有效中和抗體反應(yīng)和結(jié)合抗體反應(yīng)。