本發(fā)明屬于材料制備及應(yīng)用，具體涉及一種雙功能聚合物材料及制備方法，以及該聚合物在糖基化肽段和磷酸化肽段選擇性富集分離和疾病相關(guān)生物標(biāo)志物篩查方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蛋白糖基化和磷酸化在代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化和發(fā)育以及維持正常細(xì)胞功能和生理過程等重要生物過程中發(fā)揮著重要作用。異常的糖基化和磷酸化與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，研究與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)糖基化和磷酸化可以提供疾病診斷和治療的新策略和靶點(diǎn)。

2、然而，由于實(shí)際樣品基質(zhì)的復(fù)雜性以及糖基化和磷酸化的低豐度，糖蛋白和磷蛋白的分析面臨著挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)高效的糖蛋白和磷蛋白富集材料至關(guān)重要。

3、目前，糖基化肽段或磷酸化肽段的富集已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。親水相互作用液相色譜(hilic)由于其與質(zhì)譜技術(shù)的卓越兼容性和出色的重復(fù)性，被廣泛用于糖基化肽段富集。同時(shí)，固定金屬親和色譜(imac)，尤其是固定ti4+的imac，在高靈敏度、高選擇性和操作簡(jiǎn)便性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，因此在磷蛋白組學(xué)研究中具有很高的價(jià)值。

4、然而，將hilic和imac兩種富集策略相結(jié)合，滿足糖基化肽段和磷酸化肽段的同時(shí)富集的材料還比較少。

5、同時(shí)，富集材料不僅可以減少樣品處理時(shí)間和保留寶貴的樣品，還可以為研究人員提供多種形式的翻譯后修飾的綜合信息，從而得到更全面、準(zhǔn)確和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：目前用于糖基化肽段和磷酸肽的同時(shí)富集的材料大多是通過后合成修飾得到的，合成步驟繁瑣，也極大限制了功能基團(tuán)的負(fù)載量，導(dǎo)致富集效果不佳。

2、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種通過沉淀聚合法制備雙功能化聚合物材料的方法，以及該聚合物在糖基化肽段和磷酸化肽段選擇性富集和在蛋白組學(xué)分析中(即疾病相關(guān)生物標(biāo)志物篩查方面)的應(yīng)用。

3、本發(fā)明通過調(diào)整功能單體并采用一步聚合工藝，不僅可以高效地將hilic和imac兩種富集策略相融合，實(shí)現(xiàn)糖基化肽段和磷酸化肽段的同時(shí)富集，還可以極大提高聚合物表面特異性功能基團(tuán)的負(fù)載量，提升材料的富集性能。因此，本發(fā)明利用一步沉淀聚合開發(fā)了一種新型的表面富含二肽基團(tuán)和鈦離子靶點(diǎn)的雙功能聚合物材料(ape-mba-vpa-ti4+)，該雙功能聚合物材料在糖基化肽段和磷酸化肽段的選擇性富集方面表現(xiàn)出優(yōu)越的富集性能，在疾病相關(guān)血清生物標(biāo)志物的篩查方面具有很好的應(yīng)用前景。該雙功能聚合物材料的開發(fā)為同時(shí)富集多種翻譯后修飾類型提供了一種簡(jiǎn)單高效的方法，具有重要的商業(yè)化潛力。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

5、本發(fā)明第一方面提供一種表面富含二肽基團(tuán)和鈦離子靶點(diǎn)的雙功能聚合物材料的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

6、s1、以4-丙烯酰胺-pro-glu和乙烯基磷酸作為功能單體，以n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯(lián)劑，在自由基引發(fā)劑2,2'-偶氮二異丁腈的催化下，制備得到功能化聚合物ape-mba-vpa；

7、s2、將步驟s1所得功能化聚合物ape-mba-vpa分散到硫酸鈦水溶液中，在室溫下振蕩處理；

8、s3、將步驟s2所得產(chǎn)物經(jīng)過充分洗滌和真空干燥，得到雙功能聚合物材料ape-mba-vpa-ti4+。

9、在本發(fā)明中，采用自由基引發(fā)沉淀聚合制備二肽和磷酸-ti4+雙功能化聚合物材料，簡(jiǎn)單省時(shí)高效，反應(yīng)溫和可控；在步驟s1中引入二肽pro-glu基團(tuán)，使材料表面富含二肽基團(tuán)，可用于糖基化肽段的選擇性富集；在步驟s2中利用ti4+與磷酸基團(tuán)的螯合作用，使材料表面固定鈦離子功能化修飾，可用于磷酸化肽段的選擇性富集；將hilic和imac兩種富集策略相融合，可以用于糖基化肽段和磷酸化肽段的同時(shí)富集。

10、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟s1具體為：將4-丙烯酰胺-pro-glu，n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺，乙烯基磷酸和2,2'-偶氮二異丁腈溶解在甲苯的甲醇溶液中；在氮?dú)鈿夥障?，加熱反?yīng)；冷卻后，產(chǎn)生的沉淀經(jīng)離心分離，用甲醇洗滌，真空干燥。

11、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟s1中，反應(yīng)溫度為70-80℃，反應(yīng)時(shí)間為4-6h。

12、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟s2中，硫酸鈦水溶液的濃度為50mm，振蕩時(shí)間為2-4h。

13、本發(fā)明第二方面提供了通過上述的制備方法制得的雙功能聚合物材料。

14、本發(fā)明第三方面提供了利用上述的雙功能化聚合物材料在蛋白組學(xué)分析中的應(yīng)用，所述雙功能聚合物材料用于糖基化肽段的選擇性富集；

15、或者，所述雙功能聚合物材料用于磷酸化肽段的選擇性富集；

16、或者，所述雙功能聚合物材料用于糖基化肽段和磷酸化肽段的同時(shí)富集；

17、或者，所述雙功能聚合物材料用于疾病血清生物標(biāo)志物的篩查。

18、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，當(dāng)所述雙功能聚合物材料用于糖基化肽段的選擇性富集時(shí)，包括以下步驟：將雙功能聚合物材料分散于含有糖基化肽段的100μl由90％乙腈和0.5％三氟乙酸組成富集緩沖液中；37℃富集1小時(shí)；用上述富集緩沖液對(duì)材料進(jìn)行充分洗滌，去除非特異性吸附物質(zhì)；用由30％乙腈和0.1％三氟乙酸組成的10μl洗脫液洗脫30分鐘；取1μl洗脫液點(diǎn)靶，進(jìn)行maldi-tof?ms分析。

19、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，當(dāng)所述雙功能聚合物材料用于磷酸化肽段的選擇性富集時(shí)，包括以下步驟：將雙功能聚合物材料分散于含有磷酸化肽段的100μl由50％乙腈和0.5％三氟乙酸組成富集緩沖液中；37℃富集45分鐘；用上述富集緩沖液對(duì)材料進(jìn)行充分洗滌，去除非特異性吸附物質(zhì)；用10μl?0.4m的氨水洗脫30分鐘；取1μl洗脫液點(diǎn)靶，進(jìn)行maldi-tof?ms分析。

20、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，當(dāng)所述雙功能聚合物材料用于糖基化肽段和磷酸化肽段的同時(shí)富集時(shí)，包括以下步驟：將雙功能聚合物材料分散于含有糖基化肽段與磷酸化肽段的100μl由90％乙腈和0.5％三氟乙酸組成富集緩沖液中；37℃富集1小時(shí)；用上述富集緩沖液對(duì)材料進(jìn)行充分洗滌，去除非特異性吸附物質(zhì)；用由30％乙腈和0.1％三氟乙酸組成的10μl洗脫液洗脫30分鐘，得洗脫液a；接著用10μl?0.4m的氨水洗脫30分鐘，得洗脫液b；取1μl洗脫液a和b分別點(diǎn)靶，進(jìn)行maldi-tof?ms分析。

21、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，當(dāng)所述雙功能聚合物材料用于疾病血清生物標(biāo)志物的篩查時(shí)，包括以下步驟：將雙功能聚合物材料分散于含有血清酶解產(chǎn)物的100μl由90％乙腈和0.5％三氟乙酸組成富集緩沖液中；37℃富集1小時(shí)；用上述富集緩沖液對(duì)材料進(jìn)行充分洗滌，去除非特異性吸附物質(zhì)；用由30％乙腈和0.1％三氟乙酸組成的洗脫緩沖液洗脫30分鐘，得洗脫液a；接著用10μl?0.4m的氨水洗脫30分鐘，得洗脫液b；將洗脫液a和b分別凍干脫鹽后進(jìn)行nano?lc-ms/ms分析。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

23、1)本發(fā)明的雙功能化聚合物材料制備方法簡(jiǎn)單高效。

24、2)本發(fā)明的雙功能化聚合物材料在糖基化肽段和磷酸化肽段的選擇性富集中表現(xiàn)出很好的富集性能，不僅可以用于糖基化肽段和磷酸化肽段的單獨(dú)富集，還可以用于糖基化肽段和磷酸化肽段的同時(shí)富集，雙功能化聚合物材料特異性好，在疾病相關(guān)血清生物標(biāo)志物的篩查方面具有很好的應(yīng)用前景。

25、3)本發(fā)明雙功能聚合物材料的開發(fā)為同時(shí)富集多種翻譯后修飾類型提供了一種簡(jiǎn)單高效的方法，具有重要的商業(yè)化潛力。