本發(fā)明涉及甘油二酯的生物合成和檢測(cè)，特別涉及提高植物中1,3-甘油二酯含量的表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甘油二酯(dag)是一類甘油三酯(triacylglycerol，tg)中一個(gè)脂肪酸被羥基取代的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，分為1,3-甘油二酯和1,2-甘油二酯兩種同分異構(gòu)體。1,3-甘油二酯經(jīng)人體消化酶作用后生成甘油和游離脂肪酸，二者在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成能量，食用1,3-甘油二酯可以降低內(nèi)臟脂肪積累，抑制體重增加，具有減少血脂等作用，因而是是理想的健康油脂。

2、合成法制備甘油二酯的發(fā)展，彌補(bǔ)了天然甘油二酯在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的空缺。甘油二酯的制備方法主要有化學(xué)合成法、酶法和生物發(fā)酵法等。目前工業(yè)化使用的dag合成方法大多是化學(xué)法，反應(yīng)條件茍刻，能耗大，副反應(yīng)太多，不適合合成具有特定結(jié)構(gòu)的油脂；高溫容易導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分被破壞，催化劑的處理回收過(guò)程容易造成環(huán)境污染；產(chǎn)物感官品質(zhì)也較差，存在例如異味、顏色較深等問(wèn)題，限制了其在食品、化妝品及制藥方面的應(yīng)用。生物發(fā)酵法則存在發(fā)酵設(shè)備和酶制劑成本高，操作復(fù)雜，維護(hù)困難，產(chǎn)量受限等問(wèn)題。生物酶法催化合成1,3-甘油二酯的過(guò)程，由于脂肪酶具有精巧的選擇性(脂肪酸專一性、位置專一性、結(jié)構(gòu)專一性、光學(xué)異構(gòu)專一性)，生物酶法可對(duì)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)精確的控制，催化反應(yīng)在常溫常壓下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高，特異性強(qiáng)，不易產(chǎn)生副產(chǎn)物，避免因化學(xué)催化法而帶來(lái)的有害物質(zhì)；有利于產(chǎn)物的提取和精制，提高產(chǎn)品的品質(zhì)和價(jià)值。

3、酶法催化合成1,3-甘油二酯的方法有兩種，一種是脂肪酶催化甘油合成甘油二酯，具有合成1,3-甘油二酯特異性的脂肪酶為米根霉脂肪酶(rhizopus?oryzae?lipase，rol)；另外一種是脂肪酶催化甘油三酯水解為甘油二酯，具有1,3-甘油二酯偏好性水解脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶a(candidaantarctica?a，lipa)，反應(yīng)過(guò)程如下式所示。

4、

5、甘油二酯的檢測(cè)方法有液相色譜、質(zhì)譜、tlc(薄層色譜)法等。現(xiàn)有的液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)成本較高，操作復(fù)雜且通量低，不能較好地分離油脂中的甘油三酯、1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯、甘油單酯以及脂肪酸這全部5個(gè)物質(zhì)。tlc檢測(cè)儀器成本較低，且操作簡(jiǎn)單，可快速通量的進(jìn)行定性分析，然而現(xiàn)有的薄層色譜法并不能很好地區(qū)分油脂中的甘油三酯、1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯、甘油單酯以及脂肪酸這全部5個(gè)物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種提高大豆中1,3-甘油二酯含量的表達(dá)載體，以及利用這種表達(dá)載體篩選、培育獲得了具有高含量1,3-甘油二酯的轉(zhuǎn)基因大豆植株的方法。本項(xiàng)目選擇將南極假絲酵母脂肪酶a的表達(dá)基因轉(zhuǎn)入到大豆植株內(nèi)，使其在種子中特異性表達(dá)，直接在植物體內(nèi)催化合成1,3-甘油二酯。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因技術(shù)降低了大豆中甘油三酯的占比，提高了1,3-甘油二酯的占比。具體通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

2、一種提高植物中1,3-甘油二酯含量的表達(dá)載體，包含表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶a的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3、為了促進(jìn)南極假絲酵母脂肪酶a的目的基因在植株內(nèi)的大量表達(dá)，本發(fā)明對(duì)lipa原始序列進(jìn)行了一系列密碼子優(yōu)化。

4、進(jìn)一步地，所述植物為大豆、油菜、向日葵、花生、玉米、芝麻或棉花。

5、最優(yōu)地，所述植物為大豆。當(dāng)含有seq?id?no.1所示的目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主大豆時(shí)，南極假絲酵母脂肪酶a的目的基因在大豆植株內(nèi)的表達(dá)量最高。將相同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入其他宿主(例如油菜、向日葵、花生、玉米、芝麻或棉花)中時(shí)，表達(dá)量會(huì)略微有所降低。為了提升在其他宿主的表達(dá)量，可以采用本領(lǐng)域常用的優(yōu)化方法，對(duì)表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶a的原始基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。

6、更進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

7、南極假絲酵母脂肪酶a(cala)簡(jiǎn)稱lipa，是一種具有sn-2水解偏好性的脂肪酶，該酶可催化甘油三酯水解生成甘油二酯、單甘油酯和脂肪酸，該酶在生成甘油二酯時(shí)具有sn-2水解特異性，能夠?qū)⒏视腿ド奢^多的1,3-甘油二酯，1,3-甘油二酯對(duì)人體的健康有著很大的作用。這是因?yàn)楦视腿ゲ灰妆蝗梭w吸收，當(dāng)攝入過(guò)多的甘油三酯時(shí)，甘油三酯會(huì)在人的身體中積累和儲(chǔ)存，長(zhǎng)期以來(lái)會(huì)引發(fā)肥胖以及各種疾病；而甘油二酯易被人體吸收和代謝，最終分解和轉(zhuǎn)化成脂肪酸和能量，供人體生命活動(dòng)所需。

8、一種上述表達(dá)載體在提高植物中1,3-甘油二酯含量中的應(yīng)用。

9、一種高含量1,3-甘油二酯的轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法，其特征在于，將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到植株的組織受體細(xì)胞中，篩選出含有目的基因的存活植株，栽培獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子；測(cè)定所述種子中1,3-甘油二酯在油脂總量的占比，獲得高含量1,3-甘油二酯的轉(zhuǎn)基因植物植株。

10、上述轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法中，在將目的基因轉(zhuǎn)入植株組織的受體細(xì)胞后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該目的基因是否成功轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，需要篩選出含有目的基因的存活植株，方法具體為：通過(guò)qrt-pcr擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證和檢測(cè)；若擴(kuò)增出目的基因條帶，則表明受體細(xì)胞成功轉(zhuǎn)入目的基因；若擴(kuò)增不出，則表明轉(zhuǎn)化失敗。轉(zhuǎn)化成功的植株進(jìn)行移栽種植(移栽到大盆里)，待其結(jié)出植物種子，取對(duì)應(yīng)的植株結(jié)出的種子送去進(jìn)行蛋白組測(cè)定，若檢測(cè)出相應(yīng)的表達(dá)蛋白，則表明該目的基因在植株中成功導(dǎo)入并表達(dá)。

11、在構(gòu)建載體時(shí)，本領(lǐng)域常用方式是通過(guò)加入鏈霉素抗生素(smr)，篩選出能夠在鏈霉素抗性培養(yǎng)基上存活的菌株。

12、本發(fā)明提供的lipa轉(zhuǎn)基因(即獲得高含量1,3-甘油二酯的轉(zhuǎn)基因植物)的路線為：獲取目的基因，原核表達(dá)與純化，酶活驗(yàn)證，表達(dá)檢測(cè)(包括載體構(gòu)建、瞬轉(zhuǎn)植物葉片、亞細(xì)胞定位、酶活驗(yàn)證等步驟)，遺傳轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物分析等過(guò)程。

13、進(jìn)一步地，上述構(gòu)建方法中，測(cè)定所述種子中1,3-甘油二酯在油脂總量的占比的方法為：將所述種子的樣品使用溶劑溶解得到樣品溶液，將所述樣品溶液點(diǎn)樣至薄層色譜板上，加入展開(kāi)劑展開(kāi)，晾干，噴灑50wt％的硫酸，100-105℃顯色，觀察條帶分布并測(cè)定rf值，根據(jù)rf值計(jì)算對(duì)1,3-甘油二酯的占比。

14、進(jìn)一步地，上述構(gòu)建方法中，所述溶劑為氯仿-甲醇混合液，氯仿和甲醇的體積比為(1-3):1。

15、更進(jìn)一步地，所述溶劑中氯仿和甲醇的體積比為2:1。

16、進(jìn)一步地，所述展開(kāi)劑為正己烷-乙醚-冰乙酸混合液，正己烷、乙醚和冰乙酸的體積比為(50-70):(5-15):1。

17、更進(jìn)一步地，所述展開(kāi)劑中正己烷、乙醚和冰乙酸的體積比為60:10:1。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明通過(guò)將表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶a的目的基因轉(zhuǎn)化到大豆等植物體內(nèi)，培育、篩選獲得了一種高含量1,3-甘油二酯的轉(zhuǎn)基因植物。這種轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)利用南極假絲酵母脂肪酶a，直接在植物內(nèi)將甘油三酯催化水解獲得1,3-甘油二酯，顯著提升了所獲得的轉(zhuǎn)基因植物種子中的1,3-甘油二酯含量。

19、本發(fā)明還在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，通過(guò)改進(jìn)植物種子中1,3-甘油二酯總量的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植物的更準(zhǔn)確篩選，以及植物種子中1,3-甘油二酯總量的更準(zhǔn)確測(cè)定。