本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白及其制備方法和在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺癌是常見的癌癥類型之一，肺癌所引起的死亡約占全球所有癌癥相關(guān)死亡的18％，肺癌中85％為非小細(xì)胞肺癌(non-small?cell?lung?cancer，nsclc)。肺腺癌(lungadenocarcinoma，luad)是肺癌最常見的病理亞型，占nsclc的一半以上。luad發(fā)展迅速，惡性程度高，在診斷時，患者多已處于中晚期，嚴(yán)重影響患者的治療效果及生存質(zhì)量。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境(tumor?microenvironment，tme)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，已成為腫瘤治療的新方向。巨噬細(xì)胞對環(huán)境的反應(yīng)改變其表型信號，并分為兩種主要表型：m1和m2極化巨噬細(xì)胞。m1極化巨噬細(xì)胞的特征通過具有抗腫瘤活性和產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-6(il-6)、白細(xì)胞介蛋白-12(il-12)和干擾素γ(ifn-γ)。m2極化巨噬細(xì)胞的特征是促腫瘤活性和免疫抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生如白介素-4(il-4)、白介素-10(il-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)。巨噬細(xì)胞滲入腫瘤組織占腫瘤微環(huán)境中高達(dá)50％的細(xì)胞。在腫瘤微環(huán)境中，低氧和營養(yǎng)大量的乳酸和免疫抑制細(xì)胞因子使腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞向m2表型極化成為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tams)。因此tams分泌免疫抑制細(xì)胞因子并募集免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(tregs)和骨髓源性抑制細(xì)胞(mdscs)對腫瘤微環(huán)境的作用，并隨后促進(jìn)腫瘤生長、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。大量的tams與癌癥患者轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差相關(guān)。因此，將m2極化的促腫瘤tams轉(zhuǎn)為m1極化的抗腫瘤巨噬細(xì)胞可能是一種有效的策略用于癌癥的治療。

2、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，il-4)是一種多效免疫細(xì)胞因子，主要由活化ⅱ型輔助性t細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生。il-4只有與位于靶細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)活性。有研究表明，il-4r在許多癌癥類型包括乳腺癌和肺癌中高度上調(diào)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。也有研究表明il-4r在m2巨噬細(xì)胞上表達(dá)的水平與m1巨噬細(xì)胞相比更高，且參與對il-4響應(yīng)的m2極化反應(yīng)，抑制il-4r可削弱巨噬細(xì)胞m2極化，減少tams，從而抑制腫瘤進(jìn)展。這說明il-4r是一種潛在的在m2巨噬細(xì)胞或肺癌腫瘤細(xì)胞上的受體靶點。盡管如此，介于正常免疫細(xì)胞也表達(dá)il-4r受體，以il-4r作為靶點治療癌癥效果存在巨大差異，它在肺癌治療中的意義尚不明確。因此，發(fā)展合理的抗腫瘤抗體藥物及其他相關(guān)藥物，闡明以il-4r為靶點治療肺癌的效果及其臨床意義是非常重要的。

3、鐵蛋白作為一種天然蛋白，具有高度的生物安全性、穩(wěn)定性和可修飾性，這促使人們研究將其用作蛋白質(zhì)籠狀納米發(fā)展為診斷試劑和藥物遞送載體。特別地，近年來的研究表明小尺寸的鐵蛋白具有廣泛的生物分布特性，較抗體藥物能夠更深入地進(jìn)入實體腫瘤組織中，這使得鐵蛋白納米粒子引起人們更多的關(guān)注。有研究結(jié)果表明通過噬菌體展示鑒定的ap1肽是一種能與il-4r進(jìn)行特異性結(jié)合的多肽，能特異性地阻斷il-4rα及下游信號通路(hong?hy,lee?hy,kwak?w,et?al.phage?display?selection?of?peptides?that?home?toatherosclerotic?plaques:il-4receptor?as?acandidate?target?inatherosclerosis.j?cell?mol?med.2008；12(5b):2003-2014.)，當(dāng)其融合于鐵蛋白輕鏈亞基，所制備的融合鐵蛋白對哮喘的治療有緩解效果(jeon?jo,kim?s,choi?e,etal.designed?nanocage?displaying?ligand-specific?peptide?bunches?for?highaffinity?and?biological?activity.acs?nano.2013；7(9):7462-7471)，但將其應(yīng)用于肺癌，特別是對免疫抑制微環(huán)境導(dǎo)致t細(xì)胞高耗竭的腫瘤的治療尚未報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是為了提供一種ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白及其制備方法和在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白(ap1-fth1)由ap1短肽融合于fth1蛋白n端，具有白細(xì)胞介素-4受體的靶向，可以實現(xiàn)與il-4r的有效結(jié)合。探索抑制il-4r的信號通路，對抑制腫瘤細(xì)胞生長并改善免疫抑制腫瘤微環(huán)境，以獲得良好的抗腫瘤活性。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個目的在于提供一種ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白，包括ap1多肽和鐵蛋白重鏈亞基(fth1)，所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

4、所述ap1多肽通過連接肽融合于鐵蛋白重鏈亞基的n端。

5、進(jìn)一步地，所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白具有蛋白質(zhì)籠狀空腔結(jié)構(gòu)，所述蛋白質(zhì)籠狀空腔結(jié)構(gòu)的直徑為12～15nm，

6、蛋白質(zhì)籠狀空腔結(jié)構(gòu)的設(shè)計可以克服抗體成本高、修飾困難、不易穿透腫瘤組織的問題，均勻的尺寸和對稱結(jié)構(gòu)允許將偶數(shù)的靶向肽加載到預(yù)期區(qū)域。

7、上述更進(jìn)一步地，24個所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白亞基通過體外復(fù)性折疊組裝形成蛋白質(zhì)籠狀空腔結(jié)構(gòu)。所述蛋白質(zhì)籠狀空腔結(jié)構(gòu)由24個亞基組裝形成，這24個亞基均由ap1-fth1亞基組裝而成，與現(xiàn)有技術(shù)中ap1-fth1/anti?egfr?scfv-fth1蛋白不同。ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白僅由ap1多肽修飾的ap1-fth1融合蛋白亞基組裝而成，ap1-fth1/anti?egfr?scfv-fth1蛋白則是由ap1-fth1和anti?egfr?scfv-fth1兩種亞基組裝。本發(fā)明使得蛋白表面擁有更多的ap1多肽，因此也具有更好地靶向il-4r的效果。

8、進(jìn)一步地，所述ap1多肽的氨基酸序列如seq?id?no.1；

9、所述ap1多肽與鐵蛋白重鏈亞基融合的連接肽的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，插入該柔性連接肽有利于ap1多肽獲得正確的空間構(gòu)象，有效地與il-4r的結(jié)合。

10、本發(fā)明的第二個目的在于提供一種ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白的制備方法，具體步驟如下：

11、將含有編碼所述的ap1-fth1蛋白的dna分子的核苷酸序列的插入表達(dá)質(zhì)粒中，得到轉(zhuǎn)化體；隨后，轉(zhuǎn)化體活化培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑，分離純化培養(yǎng)物后得到ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白。

12、進(jìn)一步地，所述表達(dá)質(zhì)粒為pet-28a(+)，插入位點為在pet-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒的ncoi和not?i酶切位點之間。

13、進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)化體為e.coli.bl21(de3)/pet-28a(+)/ap1-fth1。

14、進(jìn)一步地，所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。

15、進(jìn)一步地，所述活化培養(yǎng)溫度為37℃，當(dāng)轉(zhuǎn)化體在18℃培養(yǎng)時，目標(biāo)蛋白產(chǎn)率過低，而在37℃培養(yǎng)時，蛋白產(chǎn)率明顯提高。

16、進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)劑為iptg，所述誘導(dǎo)劑濃度為1mm，當(dāng)轉(zhuǎn)化體不加誘導(dǎo)劑iptg不會產(chǎn)生蛋白，在加入誘導(dǎo)劑1mm?iptg后能夠得到較佳蛋白產(chǎn)量，當(dāng)轉(zhuǎn)不是化體在加入誘導(dǎo)劑10mm?iptg后，蛋白產(chǎn)量降低且會增加經(jīng)濟(jì)成本。

17、進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)時間為12h，當(dāng)轉(zhuǎn)化體在加入誘導(dǎo)劑iptg后培養(yǎng)3h、8h時，蛋白產(chǎn)率過低，在加入誘導(dǎo)劑iptg后培養(yǎng)24h時，時間成本過高。當(dāng)加入iptg后培養(yǎng)12h，能夠得到較佳的蛋白產(chǎn)量，同時時間成本比較合理。

18、本發(fā)明的第三個目的在于提供一種ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

19、進(jìn)一步地，所述藥物為通過ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白與il-4r特異性結(jié)合以抑制il-4r的信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞而具有抗腫瘤活性的藥物。

20、進(jìn)一步地，所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

21、上述更進(jìn)一步地，所述ap1多肽-鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白在制備治療免疫抑制微環(huán)境導(dǎo)致t細(xì)胞高耗竭的腫瘤(lewis肺癌動物模型)藥物中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明的原理如下：

23、多肽-鐵蛋白重鏈亞基的融合蛋白常見三種方式，即多肽插入于該蛋白中間的某處位點、c端融合及n端融合。插入鐵蛋白重鏈亞基的某處氨基酸序列中有可能會破壞蛋白結(jié)構(gòu)，常導(dǎo)致蛋白及修飾多肽活性不佳；而鐵蛋白重鏈亞基的c端位于蛋白內(nèi)部，受空間位阻的影響，融合的多肽常導(dǎo)致該蛋白無法正確組裝獲得應(yīng)有的特征結(jié)構(gòu)。不同于前兩種情況，n端修飾可使得融合多肽位于該蛋白表面，且空間向外伸展情況更優(yōu)，因此活性更佳。

24、本發(fā)明區(qū)別與現(xiàn)有技術(shù)中將ap1多肽融合于fth1蛋白內(nèi)部的第四和第五螺旋之間，這種融合方式可使得ap1多肽空間上獲得更大的自由度，有利于與靶點蛋白的結(jié)合(jeon?jo,kim?s,choi?e,et?al.designed?nanocage?displaying?ligand-specificpeptide?bunches?for?high?affinity?and?biological?activity.acs?nano.2013；7(9):7462-7471)。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下所示：

26、1、本發(fā)明將ap1多肽與鐵蛋白重鏈亞基(fth1)的n端融合，制備ap1-fth1蛋白，實現(xiàn)將ap1多肽展示于該蛋白表面上。由于其表面的ap1能有效地與腫瘤內(nèi)多種細(xì)胞表面過表達(dá)的il-4r結(jié)合，從而有效富集于腫瘤組織，有望在肺癌治療中發(fā)揮更優(yōu)的抗腫瘤效果。

27、2、本發(fā)明通過噬菌體展示鑒定的ap1多肽結(jié)合到fth1的n端，ap1多肽是一種能與il-4r進(jìn)行特異性結(jié)合的多肽，并有效抑制il-4r的信號通路，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tams)，抑制腫瘤的進(jìn)展。因此，ap1修飾的鐵蛋白融合蛋白可以為肺癌治療提供一種潛在的治療方式。

28、3、本發(fā)明提供的ap1-fth1能夠靶向高表達(dá)il-4r的肺癌，抑制tams，為機(jī)體提供長久有效的抑制腫瘤作用；本發(fā)明所述的納米粒子對小鼠肺癌腫瘤抑制作用明顯，有望抗腫瘤藥物實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

29、4、本發(fā)明研究顯示，ap1-fth1在體內(nèi)生理環(huán)境中安全性較好，能有效抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長，具有抗腫瘤活性，有望用于肺癌的治療，可作為新型的藥物遞送工具或藥物制劑，也為癌癥治療特別是對肺癌的治療提供了一個新思路。