本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，涉及一種鑒定生物體中外源導(dǎo)入片段是否縮短的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、野生近緣種和不同栽培類型的種質(zhì)資源中含有很多用于主栽品種改良的優(yōu)異等位基因，發(fā)掘并有效利用這些優(yōu)異等位基因，如抗病基因，有利于拓寬栽培品種的抗病能力，成為當(dāng)前改良品種抗性最主要的手段之一。但野生近緣種和不同栽培類型的種質(zhì)資源中往往同時存在許多對主栽品種農(nóng)藝、品質(zhì)或者風(fēng)格特色性狀不利的基因，在雜交和回交的過程中，如果不利基因和要轉(zhuǎn)移的目標(biāo)基因緊密連鎖，會出現(xiàn)連鎖累贅，增加優(yōu)異基因利用的難度。

2、煙草斑萎病(tobacco?spotted?wilt?disease,tswd)是由正番茄斑萎病毒屬病毒(orthotospoviruses)侵染所造成的嚴(yán)重病害。番茄斑萎病毒(tomato?spotted?wiltvirus，tswv)是正番茄斑萎病毒屬的代表種。具翼煙草(nicotiana?alata)是一種野生煙草，對tswv具有很好的抗性。利用耳狀煙草n.otophora作為橋梁親本，gajos等人成功地將tswv抗性位點(diǎn)(rtsw位點(diǎn))從具翼煙草轉(zhuǎn)育至栽培煙草(nicotiana?tabacum?l.)中，獲得了包含長rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病育種材料polalta。然而，polalta及其他包含長rtsw導(dǎo)入片段的栽培煙草都表現(xiàn)出嚴(yán)重的連鎖累贅，例如發(fā)育遲緩、葉片畸形、植株矮化和育性降低。這些連鎖累贅來源于長rtsw導(dǎo)入片段上與rtsw位點(diǎn)緊密連鎖或共分離的連鎖累贅基因組分，但具體的遺傳關(guān)系還不清楚。

3、申請?zhí)枮?02111311707.0，發(fā)明名稱為“用于篩選無連鎖累贅的抗斑萎病煙草植物的分子標(biāo)記及其應(yīng)用”的中國專利申請以及申請?zhí)枮閜ct/cn2021/129382，發(fā)明名稱為“無連鎖累贅的抗斑萎病煙草植物及其選育方法”的pct國際申請中，公開了其利用polalta和k326(主栽煙草品種)進(jìn)行雜交和回交，通過遺傳位點(diǎn)分析、分子標(biāo)記開發(fā)及大規(guī)模篩選鑒定獲得了5株無連鎖累贅的抗斑萎病煙草植物，其中含有最短rtsw導(dǎo)入片段的煙草植物k326rtsw單株12(bc7f1世代)僅含有1.6mb的rtsw導(dǎo)入片段。雖然k326rtsw單株12已去除連鎖累贅，但仍含有除rtsw基因以外的野生煙草基因組組分，這些組分可能對主栽煙草品種的基因表達(dá)造成擾動。因此，有必要篩選含有更短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草，以減少野生煙草基因組組分的影響。

4、單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，snp)在基因組中分布相當(dāng)廣泛，是植物個體間最常見的遺傳變異形式，常出現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性包括堿基的替換、顛換、插入和缺失。在基因組廣泛分布的snp大部分并不直接決定表型，但由于snp與決定表型的位點(diǎn)緊密連鎖，因此可以開發(fā)成為重要的分子標(biāo)記。snp已經(jīng)成為植物復(fù)雜性狀遺傳研究的最理想分子標(biāo)記之一。

5、競爭性等位基因特異性pcr(kompetitive?allele?specific?pcr，kasp)是通過引物末端堿基的特異匹配來對snp分型?；驹頌椋横槍Φ任换?，使用末端堿基不同且5’端分別攜帶fam和hex熒光接頭序列的兩條引物，以及含有fam和hex熒光探針的kasp預(yù)混液進(jìn)行pcr，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所攜帶的不同熒光信號，可以快速對大量樣本進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確判斷其基因型。kasp技術(shù)通過熒光檢測snp標(biāo)記，具有超高的靈活性、準(zhǔn)確度和性價比，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量和自動化檢測，在作物輔助育種應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。

6、常規(guī)的kasp主要用于基因分型檢測，利用熒光信號檢測儀或熒光定量pcr儀(配有相應(yīng)熒光探針的檢測通道)進(jìn)行信號讀取，然后用軟件采集信號并判別等位基因類型。目前已有人用kasp篩選具有短導(dǎo)入片段的個體，其在導(dǎo)入片段的兩端根據(jù)等位基因類型設(shè)計兩套不同的snp檢測引物并分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增。該方法的操作過程較為復(fù)雜，至少需要將所有樣品做兩輪pcr，分別讀取信號并綜合導(dǎo)入片段兩端的kasp結(jié)果來判斷待測個體中導(dǎo)入片段是否縮短。在大規(guī)模高通量篩選時，兩輪pcr耗時耗力，在操作過程中容易混淆樣品而造成結(jié)果錯誤，同時也加大了樣品被污染或者混合的風(fēng)險。

7、因此，迫切需要開發(fā)一種更簡便、高效和準(zhǔn)確的鑒定短導(dǎo)入片段的方法，以滿足高通量篩選的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種鑒定生物體中外源導(dǎo)入片段是否縮短的方法，其包括：

2、a)基于外源導(dǎo)入片段兩端的核苷酸序列設(shè)計并合成兩個引物對，其中第一引物對能夠特異性擴(kuò)增外源導(dǎo)入片段左端的特征序列，其上游引物的5’端含有第一接頭序列；第二引物對能夠特異性擴(kuò)增外源導(dǎo)入片段右端的特征序列，其上游引物的5’端含有第二接頭序列；并且兩個引物對均不會擴(kuò)增待測生物體的原基因組序列；

3、b)以含有外源導(dǎo)入片段的待測生物體的基因組dna為模板，使用第一引物對、第二引物對和kasp預(yù)混液進(jìn)行pcr；所述kasp預(yù)混液中包含第一熒光探針、第一淬滅探針、第二熒光探針、第二淬滅探針；第一熒光探針的核苷酸序列與第一接頭序列一致，并且與第一淬滅探針的核苷酸序列反向互補(bǔ)；第二熒光探針的核苷酸序列與第二接頭序列一致，并且與第二淬滅探針的核苷酸序列反向互補(bǔ)；第一熒光探針的5’端標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)，并且第一淬滅探針的3’端標(biāo)記有相應(yīng)的淬滅基團(tuán)；第二熒光探針的5’端標(biāo)記有第二熒光基團(tuán)，并且第二淬滅探針的3’端標(biāo)記有相應(yīng)的淬滅基團(tuán)；第一熒光基團(tuán)發(fā)出的第一熒光信號不同于第二熒光基團(tuán)發(fā)出的第二熒光信號；

4、c)pcr結(jié)束后，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號；若同時檢測到第一熒光信號和第二熒光信號，則待測生物體中的外源導(dǎo)入片段沒有縮短；若只檢測到第一熒光信號，則待測生物體中的外源導(dǎo)入片段的右端縮短；若只檢測到第二熒光信號，則待測生物體中的外源導(dǎo)入片段的左端縮短；若沒有檢測到熒光信號，則待測生物體中的外源導(dǎo)入片段兩端均縮短。

5、上述方法中，所述生物體可為植物、動物或微生物。

6、上述方法中，所述外源導(dǎo)入片段可包含用于賦予或提高所述生物體的抗病性能、生長性能或生產(chǎn)性能的目的基因以及除目的基因以外的冗余dna。

7、本發(fā)明還提供一種選育含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草的方法，其包括：

8、a)以抗斑萎病煙草polalta為父本、栽培煙草為母本進(jìn)行雜交，并以所述栽培煙草為輪回親本進(jìn)行回交，得到子代植株；

9、b)從所述子代植株中篩選具有斑萎病抗性的植株作為候選單株，然后從所述候選單株中篩選不含有第一分子標(biāo)記和/或第二分子標(biāo)記的植株，即得到含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草；

10、其中第一分子標(biāo)記和第二分子標(biāo)記的檢測方法包括：以所述候選單株的基因組dna為模板，使用第一引物對、第二引物對和kasp預(yù)混液進(jìn)行pcr；所述第一引物對的核苷酸序列如seq?id?no.5和6所示；所述第二引物對的核苷酸序列如seq?id?no.7和8所示；

11、所述kasp預(yù)混液中包含第一熒光探針、第一淬滅探針、第二熒光探針、第二淬滅探針；第一熒光探針的核苷酸序列與seq?id?no.5所示的第1-21位核苷酸序列一致，并且與第一淬滅探針的核苷酸序列反向互補(bǔ)；第二熒光探針的核苷酸序列與seq?id?no.7所示的第1-21位核苷酸序列一致，并且與第二淬滅探針的核苷酸序列反向互補(bǔ)；第一熒光探針的5’端標(biāo)記有第一熒光基團(tuán)，并且第一淬滅探針的3’端標(biāo)記有相應(yīng)的淬滅基團(tuán)；第二熒光探針的5’端標(biāo)記有第二熒光基團(tuán)，并且第二淬滅探針的3’端標(biāo)記有相應(yīng)的淬滅基團(tuán)；第一熒光基團(tuán)發(fā)出的第一熒光信號不同于第二熒光基團(tuán)發(fā)出的第二熒光信號；

12、pcr結(jié)束后，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號；只檢測到第一熒光信號或只檢測到第二熒光信號或沒有檢測到熒光信號的植株不含有第一分子標(biāo)記和/或第二分子標(biāo)記。

13、上述方法中，所述第一熒光基團(tuán)可為fam，并且所述第二熒光基團(tuán)可為hex。

14、上述方法中，所述回交為任意世代回交。

15、上述方法中，所述栽培煙草為拉丁名為nicotiana?tabacum中的任意一種栽培型煙草品種或品系。

16、本發(fā)明還提供用于篩選含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草的引物組，其包括核苷酸序列如seq?id?no.5和6所示的第一引物對和核苷酸序列如seq?id?no.7和8所示的第二引物對。

17、本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含所述的用于篩選含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草的引物組。

18、上述試劑盒還可包含用于kasp的通用試劑。

19、通過研究kasp標(biāo)記的特性，我們開發(fā)了上述鑒定生物體中外源導(dǎo)入片段是否縮短的方法。該方法是一種改進(jìn)的kasp分型方法，通過在外源導(dǎo)入片段的兩端設(shè)計含有不同熒光標(biāo)記的引物對，只需進(jìn)行一輪pcr即可鑒定待測生物體是否具有縮短的外源導(dǎo)入片段。如果導(dǎo)入片段沒有縮短，則兩端的引物對均具有擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物會產(chǎn)生兩種熒光；如果導(dǎo)入片段的一端縮短，則這一端的引物對失去模板而不能擴(kuò)增，只能檢測到另一端的引物對擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光；如果導(dǎo)入片段的兩端縮短，則兩端的引物對均失去模板而不能擴(kuò)增，沒有熒光產(chǎn)生。

20、基于上述改進(jìn)的kasp分型方法，我們開發(fā)了用于篩選含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草的scar-kasp引物組。該引物組由核苷酸序列如seq?id?no.5和6所示的第一引物對和核苷酸序列如seq?id?no.7和8所示的第二引物對組成。其中第一引物對位于rtsw導(dǎo)入片段的左端，第二引物對位于rtsw導(dǎo)入片段的右端。利用該引物組對本課題組獲得的抗斑萎病煙草bc8f1回交群體進(jìn)行篩選，獲得了5株含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草。由此可見，本發(fā)明改進(jìn)的kasp分型方法能夠有效篩選含有短rtsw導(dǎo)入片段的抗斑萎病煙草，在煙草分子育種中，特別是含有外源導(dǎo)入片段的交換單株篩選，去除外源導(dǎo)入片段帶來的連鎖累贅中具有良好的應(yīng)用前景。

21、與以往的傳統(tǒng)標(biāo)記篩選相比，本發(fā)明改進(jìn)的kasp分型方法具有準(zhǔn)確性高、成本低廉、檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模育種篩查。該方法具有通用性，可用于任何植物育種中導(dǎo)入片段縮短植株的高通量篩選。利用該方法可以在早世代進(jìn)行苗期篩選，極大地縮短定向改良的育種周期，提高育種效率。

22、除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。為使本發(fā)明更容易理解，下面對部分術(shù)語進(jìn)行解釋。

23、rtsw基因是指具翼煙草(nicotiana?alata)基因組中使具翼煙草具有抗煙草斑萎病性狀的基因。含有rtsw基因的煙草植株具有斑萎病抗性。

24、rtsw位點(diǎn)、tswv抗性位點(diǎn)或抗斑萎病基因位點(diǎn)是指具翼煙草基因組中包含rtsw基因的dna片段，該位點(diǎn)在雜合或者純合狀態(tài)下都賦予煙草植株抗煙草斑萎病性狀。

25、rtsw導(dǎo)入片段是指包含rtsw基因的具翼煙草的dna片段。含有rtsw導(dǎo)入片段的煙草植株具有抗煙草斑萎病性狀。短rtsw導(dǎo)入片段是指長rtsw導(dǎo)入片段上與rtsw基因連鎖的非rtsw基因組分部分或全部缺失，并保留完整rtsw基因功能的dna片段。導(dǎo)入是指將遺傳基因座的所需等位基因從一個遺傳背景傳遞到另一個遺傳背景。

26、回交是子一代和兩個親本的任意一個進(jìn)行雜交的一種方法。被用來回交的親本稱為輪回親本。兩個親本初始雜交產(chǎn)生f1代。bc1是指第二次使用輪回親本，bc2是指第三次使用輪回親本，以此類推。