本發(fā)明涉及生物工程，特別涉及一種高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)氨酶(ec?2.6.1.x，transaminase)屬于吡哆醛-5’-磷酸(plp)依賴的酶家族，能夠可逆地催化氨基從胺供體到胺受體的轉(zhuǎn)移，在溫和的反應(yīng)條件下通過一步催化反應(yīng)即可完成手性胺的不對稱合成，理論收率高達(dá)100％，具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、成本低以及綠色環(huán)保等優(yōu)勢，是手性胺工業(yè)合成領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的技術(shù)方法之一。

2、根據(jù)轉(zhuǎn)移氨基在碳鏈上的位置，可將轉(zhuǎn)氨酶分為α-轉(zhuǎn)氨酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶。其中，α-轉(zhuǎn)氨酶只轉(zhuǎn)移α碳上的氨基，催化α-氨基酸與α-酮酸之間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；ω-轉(zhuǎn)氨酶則可以接受底物是非α-氨基酸或非α-酮酸，即ω-轉(zhuǎn)氨酶有潛力催化任意結(jié)構(gòu)的酮酸、酮、醛、胺。然而，野生型轉(zhuǎn)氨酶由于底物結(jié)合口袋小，其天然底物主要是小分子氨基酸或酮酸等，對大型底物通常無活性或活性極低，成為制約轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺化合物在工業(yè)應(yīng)用方面的主要技術(shù)瓶頸。

3、普拉替尼(pralsetinib)是中國第一個獲批上市的選擇性受體酪氨酸激酶ret抑制劑，用于不可切除或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌和甲狀腺髓樣癌的靶向治療。普拉替尼對機(jī)體耐受性好、特異性高且具有持久的抗腫瘤活性，是目前已發(fā)現(xiàn)藥物中治療轉(zhuǎn)移性ret融合陽性非小細(xì)胞肺癌最有效的藥物。普拉替尼的手性藥物中間體(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺價格昂貴，其化學(xué)合成法由美國纜圖藥品公司開發(fā)(專利申請?zhí)枺篶n202010391097.9)，路線如下所示，涉及手性助劑、多種有機(jī)催化劑和溶劑、高溫和超低溫等復(fù)雜苛刻的反應(yīng)條件，工業(yè)化難度大、成本高。

4、

5、綜上，利用ω-轉(zhuǎn)氨酶作為催化劑不對稱合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺(直接催化ⅰ生成ⅱ)的應(yīng)用前景非常廣闊，通過分子改造提升ω-轉(zhuǎn)氨酶對非天然底物的催化性能是建立ω-轉(zhuǎn)氨酶催化合成該手性胺路線的重要前提。因此，需要開發(fā)高活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶催化劑，實現(xiàn)(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺的生物催化合成并推動綠色合成工藝的工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，通過蛋白質(zhì)工程改造提供一種對(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺的催化合成活性顯著提升的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，以解決現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)法合成成本高、有污染以及通過ω-轉(zhuǎn)氨酶催化合成時活性低的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明的第一方面，提供一種高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，該ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體是通過將如seq?id?no.1所示的野生型ω-轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列按如下任意一種突變方式得到的：第263位異亮氨酸突變?yōu)楸彼?i263a)、第263位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼?i263g)、第263位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼崆业?2位色氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?w62i/i263g)、第263位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼崆业?2位色氨酸突變?yōu)榱涟彼?w62l/i263g)、第263位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼崆业?2位色氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?w62m/i263g)。

3、本發(fā)明的第二方面，提供一種編碼如上所述的高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的基因。

4、優(yōu)選的是，編碼如seq?id?no.1所示的野生型ω-轉(zhuǎn)氨酶的核苷酸序列為seq?idno.2，編碼所述的高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的基因均是基于seq?id?no.2所示的核苷酸序列進(jìn)行定點突變獲得。

5、本發(fā)明的第三方面，提供一種包含如上所述的基因的重組質(zhì)粒。

6、本發(fā)明的第四方面，提供一種包含如上所述的基因或重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

7、優(yōu)選的是，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。

8、優(yōu)選的是，所述宿主細(xì)胞為包含如上所述的重組質(zhì)粒的大腸桿菌e.coli?bl21。

9、本發(fā)明的第五方面，提供一種如上所述的高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞，通過誘導(dǎo)表達(dá)所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，收集宿主細(xì)胞進(jìn)行破碎和離心，從上清液中分離和純化出所述的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體。

10、本發(fā)明還提供包含上述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體的可溶性蛋白或工程菌。

11、本發(fā)明的第六方面，提供一種如上所述的高催化活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體或宿主細(xì)胞在催化1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮生成普拉替尼藥物中間體(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺中的應(yīng)用。

12、優(yōu)選的是，其應(yīng)用方法為：

13、將(s)-1-苯乙胺作為胺供體，1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮作為胺受體，使用如上所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體或宿主細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行酶催化反應(yīng)，將胺供體的氨基轉(zhuǎn)移至胺受體，通過不對稱合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-胺。

14、本發(fā)明還提供了一種不對稱合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺的綠色合成方法，所述方法為將上述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體中的一種添加至反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，獲得反應(yīng)液；將反應(yīng)液進(jìn)行提取，獲得目標(biāo)手性胺。

15、優(yōu)選的是，所述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體在反應(yīng)體系中的添加濃度為0.1～1mg/ml。

16、優(yōu)選的是，進(jìn)行酶催化反應(yīng)時，所述胺供體的摩爾濃度為2～20mmol/l，所述胺受體的摩爾濃度為0.2～2mmol/l。

17、優(yōu)選的是，進(jìn)行酶催化反應(yīng)的體系包括輔酶和緩沖溶液。

18、優(yōu)選的是，所述輔酶為吡哆醛-5’-磷酸(plp)，添加濃度為0.1～2mmol/l。

19、優(yōu)選的是，所述緩沖溶液為10mm的磷酸鹽緩沖液。

20、優(yōu)選的是，酶催化反應(yīng)的溫度為37℃、ph為7～10，催化反應(yīng)的時間為2～12h。

21、本發(fā)明還提供上述ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體、上述基因、上述重組質(zhì)粒、上述宿主細(xì)胞、上述構(gòu)建方法在催化合成普拉替尼藥物中間體中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明的有益效果是：

23、本發(fā)明通過定點突變和組合突變技術(shù)將來源于嗜熱菌meiothermus?granaticius的ω-轉(zhuǎn)氨酶(seq?id?no.2)的第62位色氨酸和第263位異亮氨酸進(jìn)行突變，獲得的5種突變體(i263a、i263g、w62i/i263g、w62l/i263g和w62m/i263g)能夠高效催化1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙-1-酮不對稱合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺，37℃反應(yīng)6h的轉(zhuǎn)化率均高于80％，其中最最優(yōu)突變體w62l/i263g的轉(zhuǎn)化率高達(dá)91.37％、ee值大于99.9％，而突變之前的ω-轉(zhuǎn)氨酶野生型(wt)對該底物的轉(zhuǎn)化率僅為0.07％。從上述提升效果可以看出，本發(fā)明公開的轉(zhuǎn)氨酶突變體催化合成(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺的轉(zhuǎn)化率高、立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、工藝簡單、綠色環(huán)保，具有實現(xiàn)(s)-1-(6-(4-氟-1h-吡唑-1-甲基)吡啶-3-甲基)乙胺綠色合成路線工業(yè)化的應(yīng)用前景。