本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)病害防治的，特別是涉及一種強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、黃瓜枯萎病(cucumber?fusarium?wilt)被稱為植物中的“癌癥”，是黃瓜生產(chǎn)過程中一種破壞力極強(qiáng)的土傳病害，對(duì)黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)危害極大。黃瓜枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(fusarium?oxysporum?f.sp.cucumerium,foc)，屬于半知菌亞門(deuteromycotina)絲孢綱(hyphomycetes)從梗孢目(moniliales)瘤座孢科(tuberculariaceae)鐮刀菌屬(fusarium)。尖孢鐮刀菌黃瓜?；湍壳耙谚b定出4個(gè)生理小種，我國(guó)的病原菌屬于4號(hào)生理小種。該病原菌在25-30℃時(shí)，從黃瓜根莖部的傷口或根毛生長(zhǎng)點(diǎn)侵入并于維管束內(nèi)寄生繁殖，堵塞導(dǎo)管，阻礙植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)和水分的吸收，并能夠產(chǎn)生毒素破壞植物的防御系統(tǒng)，致使植物死亡。由于黃瓜枯萎病具有爆發(fā)性強(qiáng)、破壞力大、防控難等特征，目前，對(duì)其的防治主要以預(yù)防為主，具體方法包括：抗病品種選育、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)農(nóng)藥防治以及生物防治。

2、生物防治因?yàn)榫哂协h(huán)保、可持續(xù)等特點(diǎn)，已成為防治作物土傳病害的研究熱點(diǎn)，隨著微生物組學(xué)的快速進(jìn)展，生物防治中的核心微生物組的構(gòu)建策略越來越引人關(guān)注。根際土壤微生物組是抵御病原菌入侵植物根系的第一道防線。接種有益微生物組(群)可以在作物根際周圍形成生物屏障、抑制有害微生物、誘導(dǎo)作物產(chǎn)生免疫機(jī)能，從而對(duì)植物提供一致和持久的保護(hù)。但當(dāng)前研究主要集中在單一有益菌株的使用，忽視了微生物組對(duì)植株根際的直接或協(xié)同作用，造成單一有益菌常因根際定殖能力不強(qiáng)而無法實(shí)現(xiàn)田間穩(wěn)定抑病。

3、因此，為了解決以上問題，本技術(shù)中提供一種強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組及其制備方法與應(yīng)用，所構(gòu)建的微生物組不僅能夠避免資源競(jìng)爭(zhēng)或直接干擾導(dǎo)致作用互相抵消，而且能夠互相協(xié)同互相促進(jìn)有效抑制黃瓜枯萎病。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組及其制備方法與應(yīng)用。

2、本發(fā)明的的一種強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組，包括的菌株為：

3、1)貝萊斯芽孢桿菌(bacillus?velezensis)vjh5041，該菌株已于2024年05月10日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：m2024902；

4、2)多粘類芽孢桿菌(paenibacillus?polymyxa)sxc20-b62，該菌株已于2020年12月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.21540；

5、3)枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)yjzl20-1，該菌株已于2020年12月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.21531。

6、優(yōu)選的，上述三種菌株在培養(yǎng)基中的接種量均為：4％-12％。

7、優(yōu)選的，該方法用于對(duì)強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組的制備，具體步驟為：

8、s1：從健康黃瓜土壤中篩選對(duì)黃瓜枯萎病病原菌有較強(qiáng)抑制作用的生防菌株，生防菌株為三種，分別命名為：vjh5041、sxc20-b62和yjzl20-1，黃瓜枯萎病病原菌選用尖孢鐮刀菌黃瓜?；停?/p>

9、s2：分別驗(yàn)證三種生防菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防病效果；

10、s3：對(duì)三種生防菌株的具體種類進(jìn)行鑒定；

11、s4：對(duì)三種生防菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并確定最優(yōu)培養(yǎng)條件；

12、s5：確定核心微生物組的組成及其配比。

13、優(yōu)選的，分別驗(yàn)證步驟s3的三種生防菌株對(duì)黃瓜枯萎病的防病效果，具體的驗(yàn)證步驟為：

14、1)在健康黃瓜植株根際采集土壤樣品，采用五點(diǎn)取樣法采集土壤；

15、2)供試的病原菌選為尖孢鐮刀菌黃瓜?；?fusarium?oxysporumf.sp.cucumerinum，foc)

16、3)選擇檢測(cè)用試劑盒以及生防菌株培養(yǎng)基；

17、4)生防菌株的分離、純化以及保存；

18、5)生防菌株的篩選，篩選抑菌作用做明顯的菌株；

19、6)生防菌株對(duì)foc菌絲生長(zhǎng)影響檢測(cè)；

20、7)生防菌株對(duì)黃瓜枯萎病的生防及促生效果測(cè)定；

21、8)利用試劑盒對(duì)生防菌株誘導(dǎo)黃瓜相關(guān)防御酶活力進(jìn)行測(cè)定。

22、優(yōu)選的，步驟s4對(duì)三種生防菌株的具體種類進(jìn)行鑒定的方法為：

23、1)對(duì)生防菌株的分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定；

24、2)對(duì)生防菌株的全基因組進(jìn)行測(cè)定，具體步驟為；生防菌株的基因組dna提取、測(cè)序以及組裝；生防菌株的平均核苷酸一致性分析；生防菌株的基因組注釋分析；

25、3)鑒定后的三種生防菌株具體種類分別為：貝萊斯芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；因此三種生防菌株具體命名為：貝萊斯芽孢桿菌vjh5041、多粘類芽孢桿菌sxc20-b62以及枯草芽孢桿菌yjzl20-1。

26、優(yōu)選的，步驟s5對(duì)三種生防菌株的具體培養(yǎng)步驟為：

27、1)選擇供試菌株和供試培養(yǎng)基，供試菌株選擇為：貝萊斯芽孢桿菌vjh5041、多粘類芽孢桿菌sxc20-b62以及枯草芽孢桿菌yjzl20-1；

28、2)生防菌株種子液的制備；

29、3)三種生防菌株相容性測(cè)定；

30、4)通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化三種生防菌株的配比，該過程以核心微生物組的菌體密度od600值和對(duì)foc的抑制率作為衡量指標(biāo)，其中od600值表示菌體密度或菌群密度的指標(biāo)，通過測(cè)量樣品在600納米波長(zhǎng)處的光吸收強(qiáng)度來間接反映細(xì)菌細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中的濃度；

31、5)對(duì)核心微生物組抑制黃瓜枯萎病的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選及優(yōu)化，具體包括：碳源種類的篩選及其濃度優(yōu)化、氮源種類的篩選及其濃度優(yōu)化、無機(jī)鹽種類的篩選及其濃度優(yōu)化以及菌株基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)；

32、6)對(duì)核心微生物組的培養(yǎng)條件優(yōu)化，具體包括：核心微生物組培養(yǎng)條件優(yōu)化的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)以及核心微生物組發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化前后的對(duì)比試驗(yàn)，其中核心微生物組培養(yǎng)條件優(yōu)化的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)是根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速和初始ph，進(jìn)行響應(yīng)面程序進(jìn)行設(shè)計(jì)，程序列出的每個(gè)培養(yǎng)基組合為1個(gè)處理進(jìn)行菌株發(fā)酵培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，測(cè)定發(fā)酵液的菌體密度od600值，分析后，確定核心微生物組培養(yǎng)的最佳條件。

33、優(yōu)選的，步驟s5中核心微生物組的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基的碳源選為葡萄糖，氮源選為酵母浸粉，無機(jī)鹽選為磷酸氫二鉀，溶劑為雙蒸水，培養(yǎng)溫度為20-35℃、轉(zhuǎn)速為150-200rpm、時(shí)間為18h-24h、初始ph為5.0-7.0。

34、優(yōu)選的，步驟s5中核心微生物組的培養(yǎng)條件優(yōu)選為：培養(yǎng)基為30g葡萄糖，20g酵母浸粉，1g磷酸氫二鉀，1000ml雙蒸水，培養(yǎng)溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為171rpm、時(shí)間為21.6h、初始ph為7.0，貝萊斯芽孢桿菌vjh5041、多粘類芽孢桿菌sxc20-b62以及枯草芽孢桿菌yjzl20-1的接種量的分別設(shè)置為：4％、4％和4％。

35、一種強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組的應(yīng)用，將強(qiáng)防治黃瓜枯萎病的核心微生物組應(yīng)用于對(duì)黃瓜枯萎病的防治，并且該核心微生物組也用于對(duì)黃瓜幼苗的促生。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果為：

37、本發(fā)明從黃瓜根際土壤中篩選出了三株對(duì)黃瓜枯萎病菌具有高拮抗能力的生防菌，即vjh5041、sxc20-b62和yjzl20-1，通過全基因組測(cè)序鑒定其分別為貝萊斯芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，并且優(yōu)化設(shè)計(jì)了三種生防菌株的培養(yǎng)條件和配比，使其具有優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)效果，培養(yǎng)出來的由三種生防菌株構(gòu)建的核心微生物組對(duì)黃瓜枯萎病均具有良好的生防效果，且均能夠顯著促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)。