本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及提取和純化組織外泌體的試劑盒及提取純化外泌體的方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞外囊泡(extracellular?vesicles，ev)是一種由不同類型的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，其功能是參與細(xì)胞間的分子運(yùn)輸,幾乎存在于所有主要體液中。ev內(nèi)含有不同類型的分子，包括蛋白質(zhì)、脂類、dna、mrna、mirna等，這些內(nèi)容物質(zhì)會(huì)隨著親代細(xì)胞分泌ev時(shí)的狀態(tài)和所處環(huán)境的改變而發(fā)生改變，即ev攜帶的內(nèi)容物質(zhì)信息代表了ev分泌之初親代細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)。ev的大小從30nm到1000nm不等，可根據(jù)其生物發(fā)生、大小和生物物理性質(zhì)進(jìn)一步分類。對(duì)ev的經(jīng)典描述依據(jù)的是囊泡大小，當(dāng)直徑＜150nm時(shí)ev可被定義為外泌體。

2、現(xiàn)如今外泌體的分離和純化一直是科研工作者關(guān)注的問(wèn)題，如何獲得高純度的外泌體以及在提取外泌體的過(guò)程中保持外泌體結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于后續(xù)的研究至關(guān)重要。目前科研人員多采用超速離心、超濾、沉淀或試劑盒等方法實(shí)現(xiàn)外泌體的提取分離，但目前組織樣本外泌體的提取和純化的難度較大，目前常用方法是將組織酶解后結(jié)合差速離心法、密度梯度離心法收集外泌體。差速離心法較為成熟但難以保證差速離心后外泌體的結(jié)構(gòu)完整性，而密度梯度離心法操作復(fù)雜，且外泌體的得率較低，不適用于大多數(shù)科研人員操作，因此如何提高外泌體純度并且保持外泌體結(jié)構(gòu)的完整性，且還能保持高的得率是外泌體提取的關(guān)鍵。

3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的在于提供了提取和純化組織外泌體的試劑盒，該試劑盒通過(guò)采用沉淀試劑從而代替超速離心的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的沉淀提取，而后采用sec沉淀試劑實(shí)現(xiàn)外泌體的純化，使得所得外泌體純度和得率更高，并且能夠保持外泌體結(jié)構(gòu)的完整性。

2、本發(fā)明的第二目的在于提供了提取純化組織外泌體的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的快速提取和純化，具有方便易行且外泌體純度高的優(yōu)勢(shì)。

3、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

4、本發(fā)明提供了提取和純化組織外泌體的試劑盒，主要包括以下物質(zhì)：

5、膠原酶、沉淀試劑、sec純化載體和清洗液；

6、其中，所述沉淀試劑為聚乙二醇和pbs的混合；

7、優(yōu)選地，所述聚乙二醇和pbs的質(zhì)量比為(1-2)：(2-4)。

8、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述聚乙二醇和pbs的質(zhì)量比為1:2。

9、目前在外泌體的提取和純化中，大多是將組織樣本進(jìn)行酶解后結(jié)合差速離心法、密度梯度離心法從而實(shí)現(xiàn)外泌體的收集，但由于差速離心法較難保證離心后的外泌體的結(jié)構(gòu)完整性，從而使得所得到的外泌體在一定程度下會(huì)失去活性；而密度梯度離心法收集外泌體的操作復(fù)雜，且外泌體的得率不高。但在外泌體的應(yīng)用中，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組織外泌體可以用于疾病標(biāo)志物的篩選，如通過(guò)蛋白質(zhì)譜技術(shù)可以特異性尋找肺相關(guān)疾病蛋白標(biāo)志物，通過(guò)基因芯片和測(cè)序技術(shù)可以特異性的尋找肺相關(guān)疾病的核酸標(biāo)志物，因?yàn)楸景l(fā)明設(shè)計(jì)了一種可以實(shí)現(xiàn)組織外泌體的快速提取和純化的試劑盒，避免通過(guò)離心的方式去提取外泌體，從而保證外泌體結(jié)構(gòu)的完整性并且能夠?qū)崿F(xiàn)較高的得率。

10、在上述試劑盒中，本發(fā)明通過(guò)采用沉淀試劑從而實(shí)現(xiàn)組織外泌體的富集，其中沉淀試劑為聚乙二醇和pbs的混合。本發(fā)明所選用的聚乙二醇具有能夠沉淀捕捉外泌體的作用，能夠?qū)崿F(xiàn)組織樣本酶解后所得到的外泌體進(jìn)行沉淀和富集，而pbs的添加能夠使得聚乙二醇能夠充分溶解，從而能對(duì)酶解后的組織樣本進(jìn)行充分的沉淀，提取到得率更高的外泌體，因此可以知道，對(duì)于本發(fā)明而言，沉淀試劑中聚乙二醇和pbs缺一不可，只有當(dāng)pbs與聚乙二醇同時(shí)存在作為沉淀試劑時(shí)，其才能對(duì)酶解后的組織樣本進(jìn)行外泌體的捕捉和沉淀，若不使用pbs對(duì)聚乙二醇進(jìn)行充分溶解，則會(huì)使得沉淀試劑中的所存在的聚乙二醇含量較低，則其對(duì)于組織外泌體的沉淀效果也會(huì)相應(yīng)的受到影響，因而會(huì)使得外泌體得率較低或者外泌體無(wú)法被沉淀和捕捉；若不使用聚乙二醇而僅僅使用pbs對(duì)外泌體進(jìn)行沉淀時(shí)，經(jīng)過(guò)酶解后的組織樣本所釋放的組織外泌體并不能被沉淀和捕捉，因此可以知道，雖然聚乙二醇其具有捕捉和沉淀外泌體的效果，但其分子量的選擇和psb的質(zhì)量比對(duì)于本發(fā)明而言是非常重要的，更好的是當(dāng)沉淀試劑中聚乙二醇和pbs的質(zhì)量比為(1-2)：(2-4)時(shí)，并且當(dāng)聚乙二醇和pbs的質(zhì)量比為1:1時(shí)，通過(guò)試劑盒提取和純化后的外泌體得率是最高的，結(jié)構(gòu)完整，純度也是最高的。這是因?yàn)榫垡叶嫉奶砑訉?duì)于最終外泌體的得率是息息相關(guān)的，如果聚乙二醇添加過(guò)少時(shí)，通過(guò)酶解后的組織樣本中的外泌體不能夠被充分捕捉，從而影響得率，而其中pbs的添加則能夠保證外泌體的穩(wěn)定，使得其結(jié)構(gòu)能夠保持完整，若pbs添加過(guò)少，則會(huì)使得聚乙二醇無(wú)法充分溶解，使其對(duì)于外泌體的沉淀和捕捉效果受到影響。

11、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述聚乙二醇分子量為2000-10000；

12、優(yōu)選地，所述聚乙二醇分子量為8000。

13、在上述原料中，由于沉淀試劑中的聚乙二醇能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的沉淀和捕捉，因此其分子量的選擇對(duì)于本發(fā)明而言是非常重要的，其分子量處于2000-10000的范圍時(shí)，優(yōu)選地是當(dāng)聚乙二醇的分子量為8000，其所通過(guò)沉淀捕捉后得到的外泌體得率是較高的，若聚乙二醇的分子量過(guò)小，則會(huì)使得外泌體無(wú)法沉淀和捕捉，若分子量太大則會(huì)使得外泌體的得率下降。

14、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述sec純化載體為葡聚糖或瓊脂糖。

15、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述sec純化載體的顆粒粒徑為30nm-70nm。

16、在上述原料中，本發(fā)明在通過(guò)沉淀試劑對(duì)已經(jīng)經(jīng)過(guò)酶解后組織樣本進(jìn)行外泌體的沉淀和捕捉，但此時(shí)經(jīng)過(guò)沉淀試劑后所得到的外泌體中存在著其他蛋白，因此為了實(shí)現(xiàn)組織外泌體的純化，本發(fā)明通過(guò)采用sec方案從而實(shí)現(xiàn)外泌體的純化，其中sec為基于sec純化載體瓊脂糖或葡聚糖填料的尺寸排阻分離柱，其中通過(guò)沉淀試劑沉淀和捕捉過(guò)后所得到的外泌體會(huì)通過(guò)填充的sec純化載體的顆粒間隙，而雜質(zhì)蛋白則會(huì)進(jìn)入顆粒的孔隙從而進(jìn)行非特異性蛋白的吸附，實(shí)現(xiàn)外泌體的純化，其中對(duì)于sec純化載體的顆粒粒徑本發(fā)明也是有限定的，其中當(dāng)sec純化載體的顆粒粒徑為30nm-70nm時(shí)，其對(duì)于外泌體所達(dá)到的純化效果最好，能使得外泌體的純度更高，顆粒粒徑過(guò)小，則會(huì)使得部分大顆粒蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入顆?？紫?，和外泌體同時(shí)通過(guò)間隙獲得，影響外泌體的純度與得率；若顆粒粒徑過(guò)大則會(huì)使得部分外泌體也進(jìn)入了顆粒的孔隙，使得外泌體的得率降低。

17、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述膠原酶為i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv膠原酶型中的一種或多種。

18、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述膠原酶為i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv型膠原酶的混合。

19、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述膠原酶的濃度為0.5mg/ml-2mg/ml。

20、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，所述膠原酶中i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv型膠原酶的體積比為1：1：(1-2)：(1-2)；

21、優(yōu)選地，作為進(jìn)一步具體的實(shí)施方式，優(yōu)選地，所述i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv型膠原酶的體積比為1:1:1:1。

22、為了使得所得到的外泌體得率的純度盡可能高，本發(fā)明通過(guò)采用i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv型膠原酶的混合的方式從而對(duì)組織樣本進(jìn)行酶解，使得復(fù)合型膠原酶對(duì)于組織樣本的酶解更加充分，組織間隙外泌體的釋放也更加充分，從而使得在后續(xù)的富集中得到更多的外泌體，其中復(fù)合型膠原酶的濃度是處于0.5mg/ml-2mg/ml之間的，并且在復(fù)合型膠原酶的組成中，各個(gè)膠原酶之間也是有一定的體積比的，其中當(dāng)膠原酶中i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv型膠原酶的體積比為1：1：(1-2)：(1-2)；更好的i型膠原酶、ii型膠原酶、iii型膠原酶和iv型膠原酶的體積比為1:1:1:1時(shí)，其對(duì)于組織樣本的酶解效果較好，可以實(shí)現(xiàn)組織間隙外泌體的充分釋放，其中若是復(fù)合型膠原酶的濃度過(guò)低，則會(huì)使得組織樣本的酶解程度不充分，影響后續(xù)對(duì)于外泌體的得率，若是復(fù)合型膠原酶的濃度過(guò)高，則會(huì)對(duì)外泌體蛋白造成一定的消耗，從而影響外泌體的得率。

23、本發(fā)明還提供了上述試劑盒進(jìn)行提取純化外泌體的方法，包括以下步驟：

24、用膠原酶對(duì)組織樣本進(jìn)行酶解，得到組織間隙外泌體；

25、通過(guò)沉淀試劑對(duì)組織間隙外泌體進(jìn)行富集，而后利用sec純化載體對(duì)富集后的組織間隙外泌體進(jìn)行純化，即得組織外泌體。

26、上述方法中，適用于本發(fā)明的組織樣本包括肝組織、腦組織、肺組織、胃組織等，優(yōu)選的組織是腫瘤組織。

27、在上述制備方法，本發(fā)明通過(guò)采用膠原酶對(duì)組織樣本進(jìn)行酶解，對(duì)組織樣本中的組織間隙外泌體的釋放，通過(guò)對(duì)組織樣本采用膠原酶進(jìn)行充分的酶解，而后再通過(guò)沉淀試劑將酶解過(guò)后的組織樣本進(jìn)行外泌體的沉淀和捕捉，從而實(shí)現(xiàn)外泌體的快速提取，避免通過(guò)超速離心的方式從而獲取外泌體，可以使得外泌體的結(jié)構(gòu)保持完整，而后將通過(guò)富集的外泌體通過(guò)sec方案實(shí)現(xiàn)外泌體的純化，使外泌體通過(guò)sec尺寸分離排阻柱內(nèi)填充的sec純化載體，其中所含有的非特異性蛋白被阻攔在分離排阻柱中，而外泌體則由于分離排阻柱實(shí)現(xiàn)了與非特異性蛋白的分離，實(shí)現(xiàn)了最終外泌體的純化，使得最終所得到的外泌體純度更高，因此通過(guò)本發(fā)明的方法所獲得的組織外泌體與通過(guò)其它外泌體分離技術(shù)所獲得的總外泌體純度和得率更高，外泌體結(jié)構(gòu)完整，能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的快速提取和純化。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

29、(1)本發(fā)明提供了提取和純化組織外泌體的試劑盒，該試劑盒通過(guò)采用沉淀試劑從而代替超速離心的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的沉淀提取，而后采用sec沉淀試劑實(shí)現(xiàn)外泌體的純化，使得所得外泌體純度和得率更高，并且能夠保持外泌體結(jié)構(gòu)的完整性。

30、(2)本發(fā)明提供了提取純化組織外泌體的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的快速提取和純化，具有方便易行且外泌體純度高的優(yōu)勢(shì)。