本發(fā)明涉及園林植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種紫薇花開放關(guān)鍵基因的克隆與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紫薇(lagerstroemia?indica?l.)是千屈菜科紫薇屬的落葉小喬木或灌木植物，據(jù)《本草綱目》記載，紫薇皮、木、花有活血通經(jīng)、止痛、消腫、解毒等作用，紫薇花色鮮艷美麗，花期長，壽命長，可作盆景，園林布景是觀花喬木，具有觀賞價值，因紫薇有“官樣花”之名，民間便有診語：“門前種株紫薇花，家中富貴又榮華?！币宰限被ㄏ笳髁烁毁F繁華之意。

2、紫薇存在單花開花時間短暫，國慶期間花期已過的缺陷。對紫薇花開放的分子機(jī)理展開探究，并篩選核心調(diào)控基因，有望從源頭上改善紫薇單花期的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種紫薇花開放關(guān)鍵基因的克隆與應(yīng)用。

2、本發(fā)明還提供了一種紫薇花開放的擴(kuò)展蛋白家族基因的篩選方法。

3、一種紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1和liexla2，其核苷酸序列分別如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示。

4、本發(fā)明所述的紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1和liexla2的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列分別如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示。

5、用于克隆本發(fā)明所述的紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1和liexla2的特異性引物對，liexla1特異性引物對的核苷酸序列如seq?id?no:5和seq?id?no:6所示，liexla2特異性引物對的核苷酸序列如seq?id?no:7和seq?id?no:8所示。

6、含有本發(fā)明所述紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1或liexla2的表達(dá)載體。

7、本發(fā)明所述紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1或liexla2在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1或liexla2能夠促進(jìn)植物的花開放過程。

9、本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1或liexla2能夠增加植物莖粗、增加株高、促進(jìn)植物根長和促進(jìn)植物葉片的生長，所述紫薇花開放關(guān)鍵基因liexla1能夠增加植物的蓮座葉數(shù)量。

10、本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中，所述植物為擬南芥或紫薇。

11、一種紫薇花開放的擴(kuò)展蛋白家族基因的篩選方法，包括如下步驟：基于pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾可夫模型，搜索轉(zhuǎn)錄組中包含dpbb_1結(jié)構(gòu)域pf03330和pollen_allerg_1結(jié)構(gòu)域pf01357的基因，利用hmmer程序?qū)⒖尚哦容^高的候選基因篩選出來；同時，擬南芥擴(kuò)展蛋白的蛋白序列從tair數(shù)據(jù)庫下載，利用blast分析工具將下載的擬南芥蛋白序列同轉(zhuǎn)錄組蛋白序列進(jìn)行比對，并設(shè)定了一個嚴(yán)格的閾值條件，即e-value<1×10-10，以確保篩選出的基因具有較高的可信度；最后，結(jié)合兩種方法鑒定結(jié)果，取交集作為紫薇擴(kuò)展蛋白的候選基因；然后通過ncbi的batch?web?cd-search?tool和smart軟件驗(yàn)證候選基因的保守結(jié)構(gòu)域，將不含保守結(jié)構(gòu)域的基因剔除后，獲得最終紫薇exp基因。

12、本發(fā)明所述的紫薇花開放的擴(kuò)展蛋白家族基因的篩選方法，其還包括如下步驟：

13、(1)使用在線工具expasy?protparam計(jì)算紫薇exp家族蛋白質(zhì)的氨基酸組成、等電點(diǎn)、分子量、疏水性等基本參數(shù)；利用在線網(wǎng)站plant-mploc對紫薇exp蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；

14、(2)保守結(jié)構(gòu)域和motif的分析：利用meme在線網(wǎng)站鑒定紫薇exp基因家族蛋白序列的保守基序，設(shè)置參數(shù)為：maximum?number?of?motifs＝20；search?model＝zero?orone?occurrence?per?sequence；其余均為默認(rèn)參數(shù)值，獲得并下載紫薇exp基因家族motif的mast文件；將下載的mast文件導(dǎo)入tbtools?v1.098661軟件，對motif進(jìn)行可視化分析；利用ncbi的batch?web?cd-search?tool下載得到紫薇exp基因家族的保守結(jié)構(gòu)域dpbb1和pollen?allerg1hitdata文件，并通過tbtools?v1.098661軟件對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化分析；

15、(3)多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析：用jalview軟件對紫薇exp基因家族的氨基酸序列進(jìn)行比對，參數(shù)alignment選擇muscle?with?defaults；對鑒定的紫薇擴(kuò)展蛋白基因與擬南芥、煙草、水稻的擴(kuò)展蛋白家族序列以及與桂花、月季、香石竹、唐菖蒲、蠟梅中與花開放相關(guān)的exp基因進(jìn)行蛋白序列進(jìn)行比對；上述植物中除擬南芥外，其他植物的蛋白序列均下載于在線網(wǎng)站planttfdb；基于上述exp蛋白序列，利用mega?11軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，其中比對結(jié)果使用鄰近法構(gòu)建；接著，利用在線軟件itol對構(gòu)建的進(jìn)化樹進(jìn)行編輯和美化；

16、(4)基因的表達(dá)模式分析：采集紫薇花開放四個時期s1，s2，s3和s4的樣品，將樣品在液氮中快速冷凍后，及時提研磨提取或置于-80℃冰箱保存；總rna的提取及反轉(zhuǎn)錄；采用primer?5.0軟件設(shè)計(jì)引物，獲得的基因及引物信息如表1所示。進(jìn)行qrt-pcr擴(kuò)增，對每個選擇的基因進(jìn)行3個重復(fù)，利用2-△△ct方法計(jì)算liexps基因的相對表達(dá)量。

17、表1紫薇擴(kuò)展蛋白基因家族基因及引物

18、

19、本發(fā)明紫薇花開放關(guān)鍵基因的克隆與應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：

20、本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果克隆了liexla1和liexla2基因，并成功構(gòu)建超表達(dá)載體；通過花序侵染法轉(zhuǎn)入擬南芥，進(jìn)行功能驗(yàn)證。本發(fā)明通過全長克隆對基因liexla1和liexla2進(jìn)行克隆，并構(gòu)建得到pore-liexla1-r4和pore-liexla2-r4重組植物表達(dá)載體，然后通過花序侵染法轉(zhuǎn)基因到擬南芥。轉(zhuǎn)liexla1和liexla2基因擬南芥株系均早于野生型擬南芥開花，且花瓣面積大于野生型擬南芥。根據(jù)表型結(jié)果分析表明紫薇liexla1和liexla2具有促進(jìn)花開放作用。本發(fā)明為進(jìn)一步探究基因liexla1和liexla2是否參與紫薇花開放進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

21、經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入篩選，研究篩選出27個紫薇擴(kuò)展蛋白基因序列。通過對這些序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，成功地將它們劃分為四個不同的亞族。觀察發(fā)現(xiàn)，同一亞族內(nèi)的成員在基因結(jié)構(gòu)以及保守基序上表現(xiàn)出顯著的一致性。進(jìn)一步分析顯示，這些基因所編碼的蛋白質(zhì)長度介于249至323個氨基酸之間，分子量則介于26.54至35.65kd之間。此外，這些蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也表現(xiàn)出一定的范圍，為4.77至9.56。利用qrt-pcr分析擴(kuò)展蛋白基因家族在紫薇花開放進(jìn)程中的表達(dá)模式，根據(jù)研究，基因liexp22、liexpb1、liexpb2和liexlb1在花開放的前兩個時期展現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄水平，這表明它們可能對于花開放初期液泡的擴(kuò)展起到了重要的推動作用。而基因liexpa19，liexpa20，liexpa21，liexla1和liexla2在紫薇花開放過程中的后兩個階段表達(dá)量顯著增強(qiáng)，推測這五個基因可能是紫薇花開放功能中的關(guān)鍵調(diào)控因子。這些基因的表達(dá)上調(diào)可能直接影響到紫薇花開放過程，從而使它們在花開的機(jī)制中占據(jù)重要地位。本發(fā)明揭示出motif模式在擴(kuò)展蛋白亞家族中的保守性，這一發(fā)現(xiàn)突顯了其在亞家族中的標(biāo)志性地位，為理解擴(kuò)展蛋白的功能和進(jìn)化提供了重要線索。本發(fā)明基于紫薇花開放轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對紫薇擴(kuò)展蛋白家族進(jìn)行鑒定，并通過生物信息學(xué)軟件，分析紫薇擴(kuò)展蛋白家族的特征和變化，為進(jìn)一步研究紫薇花開放分子機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

22、下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的紫薇花開放關(guān)鍵基因的克隆與應(yīng)用作進(jìn)一步說明。