本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種抗人胱抑素c單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胱抑素c（cystatin?c，簡(jiǎn)稱cys-c），是一種堿性非糖化蛋白質(zhì)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑。它在人體幾乎所有的有核細(xì)胞中都能穩(wěn)定表達(dá)，無(wú)組織特異性，因此在各種體液中都存在。胱抑素c的基因位于人類第20號(hào)染色體上，其表達(dá)不受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化的影響，產(chǎn)生量恒定。

2、胱抑素c的主要生理功能是參與細(xì)胞內(nèi)外蛋白水解的調(diào)控，保護(hù)細(xì)胞免受不適當(dāng)?shù)膬?nèi)源性或外源性蛋白酶水解。由于胱抑素c能夠自由通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，并且被近曲小管完全重吸收并迅速代謝分解，因此其血清濃度變化不受炎癥、感染、腫瘤及肝臟疾病等因素的影響。在臨床應(yīng)用方面，胱抑素c已被用于糖尿病腎病腎臟濾過(guò)功能早期損傷的評(píng)價(jià)、評(píng)估腎移植病人腎功能的恢復(fù)情況、血液透析患者腎功能的改變等多個(gè)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的腎功能評(píng)估指標(biāo)相比，胱抑素c具有更高的敏感性和特異性，能夠更早地反映腎功能的損害。胱抑素c作為一種新型的內(nèi)源性標(biāo)志物，在醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐中展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

3、目前，檢測(cè)人尿液或血清中胱抑素c都采用免疫法，主要方法是酶聯(lián)免疫法（elisa）和免疫分散比濁法，也有采用免疫熒光試紙條和膠體金試紙條等方法，這些方法都需要用到抗人胱抑素c單克隆抗體（以下簡(jiǎn)稱“胱抑素c單克隆抗體”）。隨著全球?qū)δI臟疾病診斷和治療需求的增加，胱抑素c的單克隆抗體市場(chǎng)需求與日俱增，其不僅可以用于疾病的早期診斷，還可以用于監(jiān)測(cè)治療效果和指導(dǎo)后續(xù)治療方案；此外，胱抑素c單克隆抗體在生物醫(yī)學(xué)研究中也有重要應(yīng)用，通過(guò)對(duì)胱抑素c抗體的研究，可以深入了解腎臟疾病的分子機(jī)制，為新的治療方法的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

4、目前市場(chǎng)上提供的胱抑素c單克隆抗體存在純度不佳和特異性不足等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決cys-c單克隆抗體的制備問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種抗人胱抑素c單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)特定重組人cys-c作為抗原，刺激小鼠產(chǎn)生分泌抗人cys-c單克隆抗體的b細(xì)胞，然后通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備得到能穩(wěn)定分泌cys-c單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株能分泌高親和力的cys-c單克隆抗體，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明得到的cys-c單克隆抗體具有高效生物學(xué)活性，為cys-c單克隆抗體的生產(chǎn)提供新方法。

2、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種抗人胱抑素c單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

4、（1）將重組人胱抑素c作為抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生抗體，分離小鼠脾細(xì)胞，得到能分泌抗人胱抑素c單克隆抗體的b細(xì)胞；其中，重組人胱抑素c的氨基酸序列如seq?idno.1所示；

5、（2）將骨髓瘤細(xì)胞sp2/0與步驟（1）得到的b細(xì)胞融合，篩選出分泌抗人胱抑素c單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并采用有限稀釋法將細(xì)胞進(jìn)行克隆，篩選出經(jīng)過(guò)兩次亞克隆的穩(wěn)定分泌胱抑素c單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

6、（3）將步驟（2）制備得到的雜交瘤細(xì)胞株接種培養(yǎng)，收集細(xì)胞，注入小鼠腹腔，8~12天后，抽取小鼠腹水，從小鼠腹水中分離得到抗人胱抑素c單克隆抗體。

7、本發(fā)明通過(guò)特定重組人cys-c作為抗原，刺激小鼠產(chǎn)生分泌抗人cys-c單克隆抗體的b細(xì)胞，然后將之與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備得到能穩(wěn)定分泌cys-c單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株能分泌高親和力的cys-c單克隆抗體，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明得到的cys-c單克隆抗體具有高效生物學(xué)活性，為cys-c單克隆抗體的生產(chǎn)提供新方法。

8、作為上述制備方法的優(yōu)選，步驟（1）中，免疫小鼠的方法為：用pbs緩沖液配制濃度為0.5~2?mg/ml的胱抑素c溶液，將之與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射小鼠，免疫原用量為90~120?μg/只，相同劑量每間隔10~20天注射一次，連續(xù)接種3~4次。

9、進(jìn)一步優(yōu)選，在最后一次皮下多點(diǎn)注射胱抑素c溶液10~20天后，用人胱抑素c溶液直接注射小鼠脾臟。

10、作為上述制備方法的優(yōu)選，步驟（2）中，融合的方法為：

11、將骨髓瘤細(xì)胞sp2/0制為濃度為（1×107）~（2×107）個(gè)/ml的懸浮液；將步驟（1）得到的b細(xì)胞制為濃度為（1×108）~（2×108）個(gè)/ml的懸浮液；按骨髓瘤細(xì)胞sp2/0懸浮液與脾細(xì)胞懸浮液按體積比1:6~8的比例充分混勻，離心，棄上清，然后置于30~40℃水浴中，1~2min內(nèi)加入已預(yù)熱30~40℃的聚乙二醇-1500，邊加邊搖晃，加完后用已預(yù)熱30~40℃的無(wú)血清imdm培養(yǎng)基終止融合，離心，取沉淀，即得到融合細(xì)胞。

12、作為上述制備方法的優(yōu)選，步驟（2）中，篩選雜交瘤細(xì)胞的方法為：在酶標(biāo)板上完成胱抑素?c?抗原包被，將待篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加到酶標(biāo)板孔中，30~40℃下孵育0.5~2小時(shí)，隨后將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠igg加到酶標(biāo)板孔中，孵育后加入底物進(jìn)行顯色，選擇od450值最高的孔，得到分泌抗人胱抑素c單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

13、作為上述制備方法的優(yōu)選，步驟（3）中，培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞株采用hat培養(yǎng)基。

14、進(jìn)一步優(yōu)選，步驟（3）中，在4%~6%?co2、30~40℃條件下進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)。

15、針對(duì)不同的細(xì)胞，其培養(yǎng)條件會(huì)影響其生長(zhǎng)和發(fā)育。對(duì)于本發(fā)明得到的雜交瘤細(xì)胞株在hat培養(yǎng)基中，采用4%~6%?co2、30~40℃條件的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，得到的cys-c單克隆抗體純度高。

16、作為上述制備方法的優(yōu)選，步驟（3）中，注入小鼠腹腔的操作為：將步驟（2）制備得到的雜交瘤細(xì)胞株接種培養(yǎng)得到的細(xì)胞，制成（1×107）~（2×107）個(gè)/ml的懸液；選擇10周齡的f1小鼠，腹腔注射0.2~0.8ml液體石蠟，12~16天后，往小鼠腹腔注入180~250?μl懸液。

17、第二方面，本發(fā)明提供了一種免疫偶聯(lián)物。所述免疫偶聯(lián)物含有：

18、（a）權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)制備方法制備得到的單克隆抗體；

19、（b）選自下組的偶聯(lián)部分：可檢測(cè)標(biāo)記物、藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、和酶。

20、第三方面，本發(fā)明提供了上述制備方法制備得到的單克隆抗體或上述免疫偶聯(lián)物，在制備檢測(cè)樣品中胱抑素c的試劑、檢測(cè)、檢測(cè)板或試劑盒中的應(yīng)用。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

22、（1）本發(fā)明通過(guò)特定重組人cys-c作為抗原，刺激小鼠產(chǎn)生分泌抗人cys-c單克隆抗體的b細(xì)胞，然后將之與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備得到能穩(wěn)定分泌cys-c單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株能分泌高親和力的cys-c單克隆抗體，其能特異性結(jié)合于重組人cys-c，也能特異性結(jié)合于人尿液中天然cys-c，具有特異性好、結(jié)合率高的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于免疫法檢測(cè)人尿液以及血清中cys-c含量；

23、（2）本發(fā)明提供的制備方法具有制備純度高的優(yōu)勢(shì)，且制備方法簡(jiǎn)單，可以大規(guī)模生產(chǎn)，并進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明得到的cys-c單克隆抗體具有高效生物學(xué)活性，此為cys-c單克隆抗體的生產(chǎn)提供了新方法。