本發(fā)明涉及生物治療領域，涉及脊髓損傷的治療，尤其涉及一種kcc2截短體或其編碼序列、攜帶kcc2截短體的編碼序列的重組腺相關病毒載體及其應用。

背景技術：

1、脊髓損傷(spinal?cord?injury，sci)是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥，往往導致?lián)p傷節(jié)段以下肢體感覺和運動功能障礙。致病因素的持續(xù)存在和世界范圍內(nèi)的高發(fā)率使sci成為人類健康的嚴重威脅，也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。

2、對于sci，當前治療最突出的問題是如何有效重建損傷平面兩側(cè)神經(jīng)環(huán)路，恢復患者肢體運動和感覺功能。然而當前sci的治療手段難以滿足臨床需求和神經(jīng)環(huán)路重建的要求。已上市的小分子類藥物，如糖皮質(zhì)激素受體激動劑、磷脂酶a抑制劑、α2腎上腺素受體激動劑等均是針對原發(fā)性sci繼發(fā)的病理級聯(lián)反應，發(fā)揮抗炎、抗缺血、抑制免疫反應和神經(jīng)保護作用；手術治療亦是針對繼發(fā)性損傷，在sci患者生命體征平穩(wěn)后的24小時內(nèi)進行，減輕出血和去除壞死組織等。在研藥物中，處于ii期和iii期的干細胞結合神經(jīng)營養(yǎng)因子療法僅能從結構上重建損傷兩側(cè)神經(jīng)環(huán)路而無法重建功能環(huán)路，依然無法滿足sci的臨床需求。

3、雖然，目前研究中有利用重組病毒載體攜帶編碼全長k+-cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(全長kcc2)的核酸序列治療脊髓損傷的文獻報道(wo2019226643a1)，但因全長kcc2蛋白分子量較大(例如，其亞型之一kcc2a長度為1139aa)，其編碼序列長度約為3.4kb，在進行基因遞送載體選擇時，只能選擇較大容量的遞送載體予以遞送，導致遞送載體選擇范圍受限；另一方面，由于編碼序列過長，即使其能夠裝進遞送載體，也可能導致壓縮其它調(diào)控元件的選擇空間，例如，在現(xiàn)有技術中選擇aav載體作為遞送載體時，僅啟動子和目的基因就幾乎已經(jīng)達到遞送載體的容量上限，無法加入其它的一些調(diào)控元件，因此也難以靈活應對不同的需求。雖然現(xiàn)有技術中也存在一些kcc2截短體(例如gregory等，2011，pnas，108(37)：15474-15479；li等，2007，neuron，56(6)：1019-1033)，但這些截短體并沒有顯示出所需的生物學活性，因此不能應用于治療脊髓損傷。

4、基于以上，目前亟需探索創(chuàng)新的脊髓損傷的治療藥物和方法，尤其是需要探索既具有生物學活性，又在使用上(例如，在基因治療中)更具靈活性和廣泛性的kcc2截短體藥物。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種k+-cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(kcc2)的截短體，所述截短體在體內(nèi)和/或體外均具有生物學活性，從而具有治療脊髓損傷疾病的能力。本發(fā)明的技術方案是基于如下出人預料的發(fā)現(xiàn)而做出的：人野生型kcc2a氨基酸序列(seq?id?no：10)中第667-684位(seq?id?no：5，共18個氨基酸，本技術中稱之為“c-helices”)的氨基酸序列位于截短體的n端，對于kcc2截短體的生物學活性是關鍵的，因此，如果從上述第667位氨基酸殘基開始進行截短(即缺失第1-666位氨基酸殘基)且同時包含至少這18個氨基酸殘基的截短體，無論其長度如何，這些截短體均保留有生物學活性，甚至僅具有該18個氨基酸的短肽也能產(chǎn)生相應的生物學活性?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種kcc2截短體，其氨基酸序列選自由人野生型kcc2a氨基酸序列(seq?id?no：10)中自第667位氨基酸殘基開始至少連續(xù)18個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。

3、在一些優(yōu)選實施方案中，所述kcc2截短體的氨基酸序列選自由人野生型kcc2a氨基酸序列(seq?id?no：10)中自第667位氨基酸殘基開始連續(xù)18個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。在一些優(yōu)選實施方案中，所述kcc2截短體的氨基酸序列由人野生型全長kcc2a氨基酸序列中第667-684位氨基酸殘基所組成。在另一些優(yōu)選實施方案中，所述kcc2截短體的氨基酸序列如seq?id?no：5所示。

4、在另一些優(yōu)選實施方案中，所述kcc2截短體的氨基酸序列選自由人野生型kcc2a氨基酸序列(seq?id?no：10)中自第667位氨基酸殘基開始的連續(xù)473個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。在一些優(yōu)選實施方案中，所述kcc2截短體的氨基酸序列由人野生型全長kcc2a氨基酸序列中第667-1139位氨基酸殘基所組成。在另一些優(yōu)選實施方案中，所述kcc2截短體的氨基酸序列如seq?id?no：3所示。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼上述kcc2截短體。

6、第三方面，本發(fā)明提供一種重組核酸分子，所述重組核酸分子包含上述編碼kcc2截短體的核酸分子以及與之可操作性連接的啟動子。

7、在一些具體實施方案中，所述啟動子選自巨細胞病毒(cmv)啟動子、cag啟動子、結蛋白(des)啟動子、突觸蛋白i(syn)啟動子或肌肉肌酸激酶(mck)啟動子。在一些優(yōu)選地實施方案中，所述啟動子是突觸蛋白i(syn)啟動子。

8、在一些具體實施方案中，所述重組核酸分子還進一步包含多聚腺苷酸序列(polya)、kozak序列、wpre序列、填充序列和/或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件中的一種或多種。

9、在一些優(yōu)選的實施方案中，所述重組核酸分子包含：

10、(1)seq?id?no：11或seq?id?no：12所示的多核苷酸序列；

11、(2)在seq?id?no：11或seq?id?no：12所示的多核苷酸序列中包含一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列；或

12、(3)與seq?id?no：11或seq?id?no：12所示的多核苷酸序列具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，優(yōu)選具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的多核苷酸序列；更優(yōu)選地，具有98％或99％以上同一性的多核苷酸序列。

13、在一些具體實施方式案，所述重組核酸分子還進一步包含aav反向末端重復序列。在一些優(yōu)選實施方案中，所述aav反向末端重復序列選自不同血清型的aav。在更優(yōu)選實施方式中，所述aav反向末端重復序列選自進化支a-f中的任意血清型的aav或aav1型、aav2型、aav3型、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型或其雜交/嵌合型中的任意一個。在一些進一步優(yōu)選實施方案中，所述aav反向末端重復序列來自aav2型。

14、第四方面，本發(fā)明還提供一種重組載體，所述重組載體包含前述重組核酸分子。

15、在一些具體實施方案中，所述重組載體選自質(zhì)粒載體、噬菌體載體或病毒載體。在一些具體實施方案中，所述病毒載體選自腺相關病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體或雜合病毒載體。

16、第五方面，本發(fā)明還提供一種重組腺相關病毒，所述重組腺相關病毒包含aav衣殼和載體基因組，所述載體基因組包含上述的重組核酸分子。在一些優(yōu)選實施方案中，所述aav衣殼選自進化支a-f中的任意血清型的aav或aav1型、aav2型、aav3型、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型或其雜交/嵌合型中的任意一個。在另一些優(yōu)選實施方案中，所述重組腺相關病毒的衣殼為aavphp.b或aav9(其氨基酸序列如seq?id?no：13所示)。在一些優(yōu)選實施方案中，所述重組腺相關病毒為雙鏈重組腺相關病毒。

17、第六方面，本發(fā)明還提供一種分離的宿主細胞，所述宿主細胞包含前述的kcc2截短體、核酸分子、重組核酸分子、重組載體或重組腺相關病毒。

18、在一些具體實施方案中，所述細胞為神經(jīng)元細胞。在一些具體實施方案中所述細胞為膽堿能神經(jīng)元細胞、去甲腎上腺素能神經(jīng)元細胞、多巴胺能神經(jīng)元細胞、5-羥色胺能神經(jīng)元細胞或γ-氨基丁酸能神經(jīng)元細胞。在一些具體實施方式中，所述細胞為神經(jīng)細胞系，包括ng108-15、n1e115、pc12、shsy5y、f11、nd7-23、n27、sn4741細胞系。

19、第七方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含前述的kcc2截短體、核酸分子、重組核酸分子、重組載體、重組腺相關病毒或分離的宿主細胞以及藥學上可接受的載體和/或其它常規(guī)藥用成分(如防腐劑和/或穩(wěn)定劑)。在一些優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合物用于預防或治療脊髓損傷。在一些優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合物可配制為用于靜脈注射、鞘內(nèi)注射、腦室內(nèi)注射、脊髓內(nèi)注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、動脈內(nèi)、眼內(nèi)、肌內(nèi)、腹內(nèi)和/或其它腸胃外途徑進行給藥。在一些優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合物還可以包括其他的可用于治療脊髓損傷的藥物。

20、第八方面，本發(fā)明提供了前述的kcc2截短體、核酸分子、重組核酸分子、重組載體、重組腺相關病毒、宿主細胞和/或上述的藥物組合物在制備用于預防或治療脊髓損傷藥物中的用途。在一些實施方案中，前述的藥物組合物可以與其他用于治療脊髓損傷的藥物聯(lián)合施用。

21、第九方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中治療脊髓損傷的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用前述的kcc2截短體、核酸分子、重組核酸分子、重組載體、重組腺相關病毒、宿主細胞和/或前述的藥物組合物。在一些優(yōu)選實施方案中，所述受試者是哺乳動物。在一些更優(yōu)選實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述治療方法還可以與其他用于治療脊髓損傷的方法聯(lián)合使用。

22、本發(fā)明的積極效果在于：

23、本發(fā)明提供了一組kcc2的截短體及其編碼序列，以及攜帶其編碼序列的重組腺相關病毒，本發(fā)明提供的kcc2截短體具有良好的氯離子外排活性，并對雙側(cè)錯位截斷導致的脊髓損傷有治療效果。

24、相對于野生型全長kcc2，本發(fā)明提供的kcc2截短體的dna編碼序列較短，因此當使用基因治療時，可供選擇的基因治療遞送載體范圍更加廣泛，例如，本發(fā)明提供的kcc2截短體的dna編碼序列能夠包裝進雙鏈aav病毒載體，也能夠包裝進單鏈aav病毒載體，而野生型全長kcc2受長度限制只能包裝進單鏈aav病毒載體。同時，基因治療遞送載體中的可供選擇的啟動子及其他一些調(diào)控元件也具有較大的可選余地，能夠更加靈活和廣泛地應對不同的需求，例如，野生型全長kcc2的編碼序列(3.4kb)與啟動子包裝到單鏈aav病毒載體中后，幾乎已經(jīng)達到了該病毒載體的包裝容量上限，使得難以再在病毒載體加入其他一些表達調(diào)控元件，而本發(fā)明的kcc2截短體的dna編碼序列長度最長不超過1.5kb，即便加上啟動子，也遠未達到單鏈aav病毒載體的容量上限，仍可以基于不同的需求在病毒載體中加入其他表達調(diào)控元件。

25、下面結合附圖和具體實施方式對本公開做進一步說明，并非對本公開的限制。凡是依照本專利申請公開內(nèi)容所進行的任何本領域等同替換，均屬于本專利的保護范圍。