本發(fā)明涉及翻譯起始因子突變體、突變基因及其在制備維生素b2中的應(yīng)用，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、核黃素(riboflavin)又稱維生素b2，分子式為c17h20o6n4，是維生素b族中的一種水溶性維生素，在生物體內(nèi)以黃素單核苷酸(fmn)和黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)兩種形式存在，作為機(jī)體內(nèi)一些重要的氧化還原酶的輔酶參與氧化還原反應(yīng)，起到遞氫的作用。核黃素的缺乏會(huì)導(dǎo)致生物體代謝發(fā)生障礙，但人和動(dòng)物均不能自身合成，只能從食物中攝取，因此，核黃素在食品、飼料以及醫(yī)藥行業(yè)都具有非常廣闊的市場(chǎng)。

2、核黃素的工業(yè)生產(chǎn)方法有植物萃取法、化學(xué)合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、環(huán)境友好以及能源可再生等優(yōu)點(diǎn)逐步占據(jù)主導(dǎo)地位，成為工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法。在眾多可生產(chǎn)核黃素的微生物中，枯草芽孢桿菌(b.subtilis)作為一種非病原微生物，生理代謝及遺傳背景清楚，便于確定代謝靶點(diǎn)及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它們的發(fā)酵產(chǎn)物在食品與飼料業(yè)中已有長(zhǎng)期的應(yīng)用，對(duì)環(huán)境、醫(yī)藥和工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)都非常重要。其次枯草芽孢桿菌基因工程菌株能夠過量合成葉酸、肌苷或鳥苷，具有為核黃素過量合成提供足夠前體物的潛力，因此枯草芽孢桿菌基因工程菌在核黃素的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中逐漸顯示出了強(qiáng)大的生命力，成為主要生產(chǎn)菌株。

3、枯草芽孢桿菌(b.subtilis)中核黃素的合成需要5-磷酸核酮糖(ru5p)和鳥嘌呤-5’-三磷酸(gtp)兩個(gè)前體物質(zhì)，其中ru5p來源于磷酸戊糖途徑，gtp來源于嘌呤從頭合成途徑。二者在一系列核黃素操縱子的作用下經(jīng)7步反應(yīng)由核黃素合成途徑最終合成核黃素。

4、蛋白質(zhì)翻譯的第一步是形成30s-預(yù)起始復(fù)合物。該復(fù)合物由30srrna以及翻譯起始因子(if)組成(laursen?bs,hp,mortensen?kk,sperling-petersenhu.initiation?of?protein?synthesis?in?bacteria.microbiol?mol?biol?rev.2005mar69,1:101-23.doi:10.1128/mmbr.69.1.101-123.2005.pmid:15755955；pmcid:pmc1082788)。翻譯起始的效率對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的速率具有重要影響，是翻譯的限速步驟。枯草芽孢桿菌中翻譯起始因子包括if1、if2、if3。其中infa編碼if1蛋白，if1蛋白結(jié)合到核糖體rna的a點(diǎn)并進(jìn)行占據(jù)，迫使其移動(dòng)到p點(diǎn)。而if3蛋白的結(jié)合則促進(jìn)核糖體的解離與回收利用(gualerzi?co,pon?cl.initiation?of?mrna?translation?in?bacteria:structuraland?dynamic?aspects.cell?mol?life?sci.2015nov；72(22):4341-67.doi:10.1007/s00018-015-2010-3.epub?2015aug?11.pmid:26259514；

5、pmcid:pmc4611024)。蛋白質(zhì)合成的過程中需要氨酰-trna，其合成需要消耗atp，而多肽鏈的位移則需要消耗gtp，故蛋白質(zhì)的翻譯是一個(gè)高耗能過程。因而降低蛋白質(zhì)翻譯的速度可以有效防止其與核黃素合成途徑競(jìng)爭(zhēng)前體gtp以及能量供體atp。因而認(rèn)為翻譯起始因子會(huì)影響核黃素的合成，即翻譯起始因子編碼基因的表達(dá)水平與核黃素的合成存在一定的潛在聯(lián)系。目前，尚未有翻譯起始因子突變體基因用于維生素b2合成的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種翻譯起始因子突變體、突變基因及其在制備維生素b2中的應(yīng)用。

2、首先，本發(fā)明提供一種翻譯起始因子突變體，其特征在于，其多肽氨基酸序列相對(duì)于seq?id?no.3所示序列僅存在下述突變：第18位脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

3、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地，其氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

4、其次，本發(fā)明提供所述的翻譯起始因子突變體的編碼基因。

5、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地，所述核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

6、相應(yīng)地，本發(fā)明第三方面還提供含有所述翻譯起始因子突變體的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體。所述重組載體對(duì)出發(fā)載體并沒有特別的限制，可為本領(lǐng)域中已知的任何載體，只要它能夠在宿主中進(jìn)行復(fù)制即可。例如，所述載體包括但不限于質(zhì)粒，噬菌體。一旦轉(zhuǎn)化入合適的宿主之后，所述載體可以復(fù)制并獨(dú)立于宿主基因組發(fā)揮功能，或者在某些情況下整合入基因組本身。

7、更優(yōu)選地是重組表達(dá)載體，更優(yōu)選原核重表達(dá)載體。最優(yōu)選是適合于在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體。

8、第四方面，本發(fā)明提供含有所述翻譯起始因子突變體的編碼基因的重組宿主細(xì)胞。其中所述“宿主細(xì)胞”是具有本領(lǐng)域通常理解的含義，其能夠?qū)氡景l(fā)明的突變體的編碼基因的細(xì)胞，導(dǎo)入之后稱為重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選為原核細(xì)胞，更優(yōu)選為枯草芽孢桿菌。

9、第五方面，本發(fā)明提供翻譯起始因子突變體、其編碼基因或上述重組宿主細(xì)胞在制備維生素b2中的應(yīng)用。

10、第六方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)維生素b2的方法，其是將枯草芽孢桿菌的染色體上的翻譯起始因子編碼基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得產(chǎn)維生素b2的能力增強(qiáng)的枯草芽孢桿菌，其中所述定點(diǎn)突變是將所述編碼基因的第18位脯氨酸的編碼核苷酸替換為亮氨酸的編碼核苷酸，更具體的是所述編碼基因的第53位核苷酸c突變?yōu)閠。其中的定點(diǎn)突變可以采用本領(lǐng)域已知的各種方法來實(shí)現(xiàn)。

11、本發(fā)明第七方面，提供一種利用上述第六方面的方法獲得的枯草芽孢桿菌制備維生素b2的方法，其包括培養(yǎng)所述枯草芽孢桿菌，以及收集維生素b2的步驟，更優(yōu)選還包括純化維生素b2的步驟。

12、其中枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)可以根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行，例如搖瓶培養(yǎng)、批次培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)等，并可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的培養(yǎng)條件如溫度、時(shí)間和培養(yǎng)基的ph值等。此外，可以從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收或純化維生素b2的方法可采取本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如過濾、陰離子交換色譜、結(jié)晶和hplc等方法。

13、本發(fā)明選取枯草芽孢桿菌翻譯起始因子(if1)編碼基因的infa基因，對(duì)其第18位脯氨酸定點(diǎn)突變?yōu)榱涟彼?，得到翻譯起始因子突變體(p18l)。發(fā)現(xiàn)翻譯起始因子突變體(p18l)導(dǎo)致翻譯起始因子活性降低，并且翻譯起始因子活性的降低不能通過其他翻譯起始因子進(jìn)行補(bǔ)償。即infa突變體會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯起始速率和翻譯效率的減慢，但不至于導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此可以為維生素b2合成節(jié)約前體及能量，進(jìn)而提高維生素b2的產(chǎn)量。

14、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明以翻譯起始因子infa為基礎(chǔ)，選擇第18位的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，將枯草芽孢桿菌中翻譯起始因子編碼基因infa變?yōu)榉g起始因子突變體(p18l)與出發(fā)菌的枯草芽孢桿菌相比，含有翻譯起始因子突變體(p18l)的菌株可以提高產(chǎn)維生素b2的能力達(dá)13.5％，因而在制備維生素b2中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，經(jīng)研究證實(shí)，本發(fā)明中含有翻譯起始因子突變基因的基因工程菌生物安全，進(jìn)一步的，實(shí)驗(yàn)表明染色體上基因突變不僅未對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成影響，反而對(duì)菌體的生長(zhǎng)有益，故可以進(jìn)一步地提高含有翻譯起始因子突變體(p18l)的菌株生產(chǎn)維生素b2的能力。