本發(fā)明屬于生物學(xué)，尤其涉及一種制備具有高增殖能力的干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、干細(xì)胞，作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性發(fā)現(xiàn)，憑借其卓越的自我更新能力和多向分化潛能，已成為再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞治療以及組織工程等領(lǐng)域的關(guān)鍵要素。干細(xì)胞具有分化成多種成熟細(xì)胞類型的能力，為治療諸如帕金森病、心臟病、糖尿病和骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病提供了新的希望。在實(shí)現(xiàn)這些治療潛力之前，一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)是干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，即在控制的實(shí)驗(yàn)室條件下增加干細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)保持其多能性和遺傳穩(wěn)定性。

2、細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)是細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，它在干細(xì)胞的生物學(xué)行為中扮演著至關(guān)重要的角色。ecm不僅為干細(xì)胞提供了必要的物理支撐，使其能夠維持結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，而且還通過(guò)與細(xì)胞表面的多種受體相互作用，參與到干細(xì)胞的增殖、分化以及功能的調(diào)控中。這些相互作用包括但不限于細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞間通訊，這些過(guò)程對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性和誘導(dǎo)其向特定細(xì)胞系分化至關(guān)重要。

3、然而，ecm的獲取過(guò)程往往復(fù)雜，并且伴隨著較高的成本。這不僅限制了干細(xì)胞研究和應(yīng)用的廣泛性，也增加了相關(guān)研究和治療的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，如何有效地加快干細(xì)胞的增殖，以減少對(duì)ecm的依賴和使用，成為了當(dāng)前干細(xì)胞研究領(lǐng)域中一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

4、amarogentin(苦龍膽酯苷)是一種獨(dú)特的裂環(huán)烯醚萜苷，主要來(lái)源于swertia和gentiana屬植物的根部。其結(jié)構(gòu)式如式i所示，其cas?no.:21018-84-8?？帻埬戸ボ漳軌蛴行宄杂苫?，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，從而有助于預(yù)防多種與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病。同時(shí)，苦龍膽酯苷在抗腫瘤和抗糖尿病方面也顯示出了顯著的效果。除此之外，其在保肝，免疫調(diào)節(jié)和血管代謝方面也顯示出一定的作用。綜上所述，amarogentin作為一種多效性的天然化合物，其在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提高制備具有高增殖能力的干細(xì)胞和高干細(xì)胞干性維持能力的方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種制備具有高增殖能力的干細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟：

4、(1)將干細(xì)胞接種到細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；

5、(2)在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基；

6、(3)將所述細(xì)胞培養(yǎng)皿放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，得到具有高增殖能力的干細(xì)胞。

7、優(yōu)選地，所述干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

8、優(yōu)選地，所述細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿的制備方法包括如下步驟：

9、(1)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含有10％?fbs的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

10、(2)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到75-90％以上時(shí)，更換為40-100μg/ml抗壞血酸的細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)12-14d；

11、(3)去除細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入含20mmol/l?nh4oh和0.5-1％triton?x-100的pbs室溫進(jìn)行脫細(xì)胞處理30min；

12、(4)使用pbs清洗2-3次后，加入含100u/ml?dna酶的pbs溶液，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，處理1-2h；

13、(5)去含dna酶的pbs溶液，使用pbs清洗2-3次后，得到細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿。

14、優(yōu)選地，所述細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含5μmol/l福司可林、10μg/l堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5μg/l血小板衍生生長(zhǎng)因子，200μg/l重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白β1、10％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)基。

15、優(yōu)選地，所述含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基中苦龍膽脂甙的濃度為25μm-50μm；

16、所述培養(yǎng)基為含10％?fbs的dmem培養(yǎng)基；

17、所述培養(yǎng)一定時(shí)間為培養(yǎng)大于等于48h。

18、其次，本發(fā)明提供了一種提高干細(xì)胞干性維持能力的方法，所述方法包括如下步驟：

19、(1)將干細(xì)胞接種到細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；

20、(2)在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基；

21、(3)將所述細(xì)胞培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到80-90％左右時(shí)，按照1：2的比例將細(xì)胞接種到細(xì)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿中，加入含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞傳代。

22、優(yōu)選地，所述干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

23、所述細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿按照權(quán)利要求3中所述的細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿的制備方法制備得到；

24、所述含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基中苦龍膽脂甙的濃度為25μm-50μm；

25、所述培養(yǎng)基為含10％?fbs的dmem培養(yǎng)基。

26、其次，本發(fā)明提供了苦龍膽脂甙在增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的干細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用效果中的應(yīng)用，所述細(xì)胞外基質(zhì)的干細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用效果為細(xì)胞外基質(zhì)增強(qiáng)干細(xì)胞增殖和維持干細(xì)胞干性的效果。

27、優(yōu)選地，所述細(xì)胞外基質(zhì)的使用方式為包被細(xì)胞培養(yǎng)皿，得到細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿；

28、所述細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿按照權(quán)利要求3中所述的細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿的制備方法制備得到；

29、所述苦龍膽脂甙的使用方式為制備成含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基；

30、所述含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基中苦龍膽脂甙的濃度為25μm-50μm。

31、所述培養(yǎng)基為含10％?fbs的dmem培養(yǎng)基。

32、其次，本發(fā)明提供了一種組合物在增強(qiáng)干細(xì)胞增殖能力和干細(xì)胞維持能力中的應(yīng)用，所述組合物由含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基和細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿組成；

33、所述干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；

34、所述含苦龍膽脂甙的培養(yǎng)基中苦龍膽脂甙的濃度為25μm-50μm；

35、所述培養(yǎng)基為含10％?fbs的dmem培養(yǎng)基。

36、所述細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿按照權(quán)利要求3中所述的細(xì)胞外基質(zhì)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿的制備方法制備得到。

37、本發(fā)明的有益效果在于：

38、1.本發(fā)明提供了一種提高干細(xì)胞增殖能力的方法，與單獨(dú)使用細(xì)胞外基質(zhì)或苦龍膽脂甙相比，將二者聯(lián)合使用時(shí)，可以顯著提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力。這為獲得大量高質(zhì)量干細(xì)胞種群提供了一種新的有效策略。

39、2.本發(fā)明提供了一種維持和增強(qiáng)干細(xì)胞干性的方法，苦龍膽脂甙和細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)同作用能夠顯著上調(diào)干細(xì)胞中干性相關(guān)基因sox2和oct4的表達(dá)水平。這有利于延緩干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中干性的喪失，從而確保干細(xì)胞保持其多向分化潛能。

40、3.本發(fā)明減少對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的依賴和降低培養(yǎng)成本，傳統(tǒng)的干細(xì)胞培養(yǎng)需要大量使用細(xì)胞外基質(zhì)，但細(xì)胞外基質(zhì)的獲取過(guò)程復(fù)雜且成本較高。本發(fā)明提供了一種新方法，通過(guò)苦龍膽脂甙與細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)同作用，可以減少對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的使用需求，從而降低了培養(yǎng)成本。

41、4.本發(fā)明為干細(xì)胞臨床應(yīng)用提供新途徑，本發(fā)明揭示的苦龍膽脂甙和細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)同增效作用，不僅有助于體外擴(kuò)增高質(zhì)量干細(xì)胞，而且有望提高干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)等臨床應(yīng)用中的療效，為促進(jìn)干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化提供了新的技術(shù)途徑。

42、5.本發(fā)明為苦龍膽脂甙提供新的應(yīng)用領(lǐng)域，拓展了天然產(chǎn)物苦龍膽脂甙在干細(xì)胞研究和應(yīng)用領(lǐng)域的新用途，為該化合物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的深入開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。