本發(fā)明屬于酶工程，涉及一種提高熱穩(wěn)定性的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其在紅景天苷合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紅景天苷是紅景天中的主要藥用成分。臨床研究結(jié)果表明，紅景天苷不但具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射、抗病毒、抗腫瘤等主要功能，而且還具有增強(qiáng)注意力、提高工作效率、延緩機(jī)體衰老、防止老年疾病等功效，尤其在軍事醫(yī)學(xué)、航天醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和保健醫(yī)學(xué)等方面具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，是一種極具開(kāi)發(fā)前景的環(huán)境適應(yīng)藥物，近年來(lái)備受關(guān)注。紅景天苷無(wú)毒無(wú)害，可直接作為天然保健食品或藥品，也可添加到焙烤制品、肉制品、面制品、乳制品、果凍、飲料等幾乎大部分食品中。紅景天苷在化妝品、飼料添加劑方面也有很好的市場(chǎng)前景。紅景天苷目前的生產(chǎn)方式主要有植物提取和化學(xué)合成兩種。紅景天生長(zhǎng)于高寒無(wú)污染地區(qū)，野生資源珍稀，紅景天苷含量很低，采用植物提取方法會(huì)破壞紅景天野生的植物資源，且價(jià)格昂貴。而采用化學(xué)合成方法需要選擇性保護(hù)、活化或使用昂貴的金屬催化劑等，成本較高，容易造成環(huán)境污染。

2、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases,gt；ec?2.4.x.y)是一類(lèi)能夠催化糖基部分從活化的糖基供體分子轉(zhuǎn)移到特定糖基受體分子并形成糖苷鍵的酶。催化的糖基化反應(yīng)是合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣同時(shí)具有生理活性功能的糖苷類(lèi)化合物的關(guān)鍵步驟。相比化學(xué)法，糖基轉(zhuǎn)移酶所介導(dǎo)的糖基化反應(yīng)無(wú)需繁瑣的保護(hù)與脫保護(hù)，無(wú)需使用紅磷、溴素等對(duì)人體和環(huán)境具有危害作用的催化劑，是一種對(duì)環(huán)境友好的生物修飾方法。因此，通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化酪醇合成紅景天苷，在有機(jī)合成領(lǐng)域受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。由于多數(shù)具有重要藥理藥效的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)于植物中，植物源糖基轉(zhuǎn)移酶成為人們的主要研究對(duì)象，然而，植物來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶存在表達(dá)難、包涵體嚴(yán)重的問(wèn)題，嚴(yán)重限制了糖基轉(zhuǎn)移酶在紅景天苷合成中的應(yīng)用。相比植物來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶，微生物源糖基轉(zhuǎn)移酶容易采用釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等模式菌株異源表達(dá)，更易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。申請(qǐng)人前期通過(guò)分子改造獲得了一株能夠選擇性催化酪醇c8-oh發(fā)生糖基化法應(yīng)生成紅景天苷的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體blyjicm6(cn117551718a中的ugt突變體氨基酸序列)。然而，該酶穩(wěn)定性較差，在40℃下的半衰期僅為48.1min，在申請(qǐng)人構(gòu)建的多酶催化體系中(cn117551718a)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間完成對(duì)酪醇的轉(zhuǎn)化，限制了該酶在紅景天苷合成中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。因此，通過(guò)分子改造進(jìn)一步提高微生物糖基轉(zhuǎn)移酶突變體blyjic?m6的熱穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)紅景天苷真正的酶法工業(yè)合成的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)微生物糖基轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性差的問(wèn)題，通過(guò)綜合計(jì)算和定點(diǎn)突變的方式獲得了一系列熱穩(wěn)定性顯著提高的糖基轉(zhuǎn)移酶單點(diǎn)突變株，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)組合突變，獲得了一系列熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的糖基轉(zhuǎn)移酶組合突變體，顯著提高了紅景天苷的產(chǎn)量。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的，提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，具體如下：

3、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第304位蘇氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)、第123位苯丙氨酸(phe)、第344位的蘇氨酸(thr)、第271位的天冬氨酸(asp)分別突變?yōu)槔i氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)、色氨酸(trp)、纈氨酸(val)、甘氨酸(gly)；或

4、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第304位蘇氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)、第123位苯丙氨酸(phe)、第344位的蘇氨酸(thr)分別突變?yōu)槔i氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)、色氨酸(trp)、纈氨酸(val)；或

5、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第304位蘇氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)、第123位苯丙氨酸(phe)分別突變?yōu)槔i氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)、色氨酸(trp)；或

6、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第304位蘇氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)、第309位的天冬酰胺(asn)分別突變?yōu)槔i氨酸(val)、丙氨酸(ala)、色氨酸(trp)；

7、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第304位蘇氨酸(thr)、第307位的甘氨酸(gly)分別突變?yōu)槔i氨酸(val)和丙氨酸(ala)。

8、以上為組合突變體，而單點(diǎn)突變體則如下所示：

9、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第123位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)樯彼?trp)；或

10、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第271位天冬氨酸(asp)突變?yōu)楦拾彼?gly)；或

11、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第304位蘇氨酸(thr)突變?yōu)槔i氨酸(val)；或

12、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第307位的甘氨酸(gly)突變?yōu)楸彼?ala)；或

13、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第309位的天冬酰胺(asn)突變?yōu)槔野彼?tyr)；或

14、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第309位的天冬酰胺(asn)突變?yōu)樯彼?trp)；或

15、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第344位的蘇氨酸(thr)突變?yōu)槔i氨酸(val)；或

16、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第366位的異亮氨酸(ile)突變?yōu)槔i氨酸(val)；或

17、將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第381位的賴(lài)氨酸(lys)突變?yōu)榫彼?arg)。

18、本發(fā)明的第二個(gè)目的，提供一種編碼前述的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸分子。

19、本發(fā)明的第三個(gè)目的，提供一種包含前述的核苷酸分子的載體。

20、本發(fā)明的第四個(gè)目的，提供一種表達(dá)前述的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的重組菌。

21、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組菌以芽孢桿菌、大腸桿菌、酵母中的任意一種為宿主菌。

22、本發(fā)明的第五個(gè)目的，提供一種前述的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體、或前述的核苷酸分子、或前述的表達(dá)載體、或者前述的重組菌在紅景天苷合成中的應(yīng)用。

23、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組菌在合成體系中的濃度為20-30g·l-1。合成體系的溫度為35-50℃。

24、具體地，重組菌表達(dá)l-氨基酸脫氨酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、蔗糖合酶、所述的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，以l-酪氨酸為底物通過(guò)多酶級(jí)聯(lián)合成紅景天苷。

25、糖基轉(zhuǎn)移酶突變體可以聯(lián)合其它酶形成多酶級(jí)聯(lián)催化體系，也可以單獨(dú)使用(例如直接以酪醇為底物催化合成紅景天苷，可以采用更高的溫度40-50℃以加快反應(yīng)速率)。

26、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明首先采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的方式，篩選獲得一系列熱穩(wěn)定性顯著提高的單點(diǎn)突變株，隨后通過(guò)對(duì)單點(diǎn)突變進(jìn)行有序組合，獲得了熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的2點(diǎn)至6點(diǎn)組合突變株，熱穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示最優(yōu)突變體在40℃的半衰期相比于原始酶提高了133.5倍。將本發(fā)明獲得的熱穩(wěn)定性突變體用于紅景天苷的多酶合成，產(chǎn)量均獲得了顯著提高，最高達(dá)到13.8g/l，是未突變前的4.2倍。本發(fā)明成功地解決了紅景天苷酶法合成過(guò)程中糖基轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性差的關(guān)鍵問(wèn)題，表現(xiàn)出非常大的工業(yè)應(yīng)用前景。