提供了一種抗4-1bb/抗her2雙特異性抗體、藥物組合物及使用其治療和/或預(yù)防癌癥的方法。

背景技術(shù)：

1、4-1bb蛋白是tnf受體超家族(tnfrsf)的成員并且是一種共刺激分子，其在免疫細(xì)胞(固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞兩者)活化后表達(dá)。4-1bb在調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞的活性中起重要作用。4-1bb激動(dòng)劑增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖和存活、細(xì)胞因子的分泌以及cd8?t細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。許多其他研究顯示，4-1bb的活化增強(qiáng)了免疫應(yīng)答，從而消除了小鼠體內(nèi)的腫瘤。因此，提示4-1bb是癌癥免疫學(xué)中有希望的靶分子。盡管抗4-1bb抗體具有抗腫瘤功效，但它們?cè)谂R床應(yīng)用中可引起嚴(yán)重的肝毒性。

2、her2蛋白是表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)家族的成員，參與到與腫瘤相關(guān)的多種機(jī)制。her2是一種典型的受體酪氨酸激酶(rtk)，存在于細(xì)胞表面，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖和滲透、血管生成等。

3、同時(shí)，針對(duì)兩種或更多種抗原的多特異性抗體已經(jīng)開發(fā)出各種種類和形式，并預(yù)期作為與單克隆抗體相比具有優(yōu)異治療效果的新藥抗體。

4、因此，需要開發(fā)一種能夠識(shí)別一種存在于癌細(xì)胞上而另一種存在于諸如免疫細(xì)胞的其他細(xì)胞上的兩種不同抗原的多特異性抗體，以用于更有效的癌癥治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一種實(shí)施方式提供了抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含：

2、(1)作為her2靶向部分的抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性識(shí)別和/或結(jié)合her2蛋白；和

3、(2)作為4-1bb靶向部分的抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性識(shí)別和/或結(jié)合4-1bb蛋白。

4、另一種實(shí)施方式提供了包含該雙特異性抗體的藥物組合物。該藥物組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

5、另一種實(shí)施方式提供了用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的藥物組合物，該組合物包含雙特異性抗體。

6、另一種實(shí)施方式提供了一種在有需要的受試者中治療和/或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將藥學(xué)有效量的雙特異性抗體或藥物組合物施用至受試者。該方法可以進(jìn)一步包括在施用步驟之前鑒定需要治療和/或預(yù)防癌癥的受試者的步驟。

7、另一種實(shí)施方式提供了一種在有需要的受試者中增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將藥學(xué)有效量的雙特異性抗體或藥物組合物施用至受試者。該方法可以進(jìn)一步包括在施用步驟之前鑒定需要增強(qiáng)免疫應(yīng)答的受試者的步驟。

8、另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體或藥物組合物用于治療和/或預(yù)防癌癥的用途。另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。

9、另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體或藥物組合物用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途。另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體在制備用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的藥物中的用途。

10、一種實(shí)施方式提供了編碼雙特異性抗體的多核苷酸。

11、一種實(shí)施方式提供了包含多核苷酸的重組載體。重組載體可用作編碼雙特異性抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。

12、另一種實(shí)施方式提供了包含編碼雙特異性抗體的多核苷酸的細(xì)胞。細(xì)胞可以是用包含多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞。

13、另一種實(shí)施方式提供了制備雙特異性抗體的方法，包括在細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸。表達(dá)多核苷酸的步驟可以通過在允許多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸(例如該多核苷酸在重組載體中)的細(xì)胞來進(jìn)行。

14、解決技術(shù)問題的技術(shù)方案

15、本公開涉及雙特異性抗體及其用途，所述雙特異性抗體中的每一種都包括對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(taa；her2)特異的抗體和對(duì)4-1bb特異的抗體。這些雙特異性抗體僅在存在her2表達(dá)細(xì)胞的情況下活化4-1bb信號(hào)傳導(dǎo)并增強(qiáng)強(qiáng)免疫細(xì)胞。由于特異性her2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，預(yù)計(jì)與4-1bb單克隆抗體相比，使用雙特異性抗體的肝毒性要小得多。

16、在本公開中，提供了抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體及其用途，其中該抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體可以包含：

17、(1)作為her2靶向部分的抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性識(shí)別和/或結(jié)合her2蛋白；和

18、(2)作為4-1bb靶向部分的抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性識(shí)別和/或結(jié)合4-1bb蛋白。

19、在下文中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

20、定義

21、如本文所用，“由序列組成”、“基本上由序列組成”或“包含序列”可以指包含該序列的任何情況，但它可能不旨在排除包含除了該序列之外的其他序列的情況。

22、如本文所用，術(shù)語“包含由seq?id?no識(shí)別的氨基酸序列或由其組成的蛋白質(zhì)或多肽”和“包含由seq?id?no識(shí)別的核酸序列或由其組成的基因或多核苷酸”可以指基本上由該氨基酸序列或核酸序列組成，或與該氨基酸序列或核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性并保持其固有的活性和/或功能的蛋白質(zhì)(或多肽)或基因(或多核苷酸)。

23、如本文所用，術(shù)語“抗體”可以涵蓋可以在生化上區(qū)別的各類多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，重鏈被分類為γ、μ、α、δ或ε及一些子類(例如γ1至γ4)，輕鏈則被分類為κ或λ。該鏈的性質(zhì)決定了抗體的“類別”分別為igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亞類(同種型)例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等已被很好地表征，并且已知賦予功能專門化。

24、完整的抗體包括兩條全長(zhǎng)輕鏈和兩條全長(zhǎng)重鏈，其中每條輕鏈通過二硫鍵連接到重鏈。該抗體具有重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)是γ、μ、α、δ或ε型，可進(jìn)一步分類為γ1、γ2、γ3、γ4、α1或α2。輕鏈恒定區(qū)是κ或λ類型。

25、術(shù)語“重鏈”是指全長(zhǎng)重鏈或其片段，包括足以提供對(duì)抗原的特異性的氨基酸序列的可變區(qū)vh、以及三個(gè)恒定區(qū)ch1、ch2和ch3、以及鉸鏈。術(shù)語“輕鏈”是指全長(zhǎng)輕鏈或其片段，包括足以提供對(duì)抗原的特異性的氨基酸序列的可變區(qū)vl、以及恒定區(qū)cl。

26、術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)”是指在免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的高可變區(qū)發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。重鏈和輕鏈可以分別包括三個(gè)cdr(cdrh1、cdrh2和cdrh3；以及cdrl1、cdrl2和cdrl3)。cdr可以提供在抗體與抗原或表位結(jié)合中起重要作用的殘基。術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性識(shí)別”為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，并且表示抗體和抗原彼此特異性相互作用以產(chǎn)生免疫活性。

27、在本公開中，抗體可以包括但不限于多克隆抗體或單克隆抗體；和/或人抗體、人源化抗體、動(dòng)物(例如，小鼠、兔等)源性抗體、或嵌合抗體(例如小鼠-人嵌合抗體)。

28、通過用所需抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的動(dòng)物源性抗體在施用于人以用于治療目的時(shí)通常會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，已經(jīng)開發(fā)了嵌合抗體來抑制這種免疫排斥反應(yīng)。嵌合抗體是通過使用基因工程方法將引起抗同種型反應(yīng)的動(dòng)物源性抗體的恒定區(qū)替換為人抗體的恒定區(qū)而形成的。與動(dòng)物源性抗體相比，嵌合抗體的抗同種型反應(yīng)顯著改善，但動(dòng)物源性氨基酸仍然存在于其可變區(qū)，因此它仍然含有由抗獨(dú)特型反應(yīng)引起的潛在副作用。因此人源化抗體已被開發(fā)用于改善此類副作用。這是通過將嵌合抗體可變區(qū)中的在抗原結(jié)合中起重要作用的cdr(互補(bǔ)決定區(qū))移植到人抗體框架中而制造的。

29、如本文所用，術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指衍生自完整免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的片段，該片段包括能夠結(jié)合抗原的部分，例如cdr。例如，抗原結(jié)合片段可以是scfv、(scfv)2、fab、fab'或f(ab')2，但不限于此。在本公開中，抗原結(jié)合片段可以是衍生自抗體的片段，包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，例如選自scfv、(scfv)2、scfv-fc、fab、fab'和f(ab')2。

30、在抗原結(jié)合片段中，fab是具有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(ch1)的結(jié)構(gòu)，其具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn).

31、fab'與fab的不同之處在于它在重鏈ch1域的c端具有包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。f(ab')2抗體是通過fab'鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基的二硫鍵形成的。

32、fv是僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的最小抗體片段，并且用于產(chǎn)生fv片段的重組技術(shù)在相關(guān)領(lǐng)域中是眾所周知的。雙鏈fv可以具有重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)通過非共價(jià)鍵連接的結(jié)構(gòu)，單鏈fv(scfv)通常具有二聚體結(jié)構(gòu)，如雙鏈fv，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過肽接頭共價(jià)連接或它們?cè)谄鋍端彼此直接連接。

33、抗原結(jié)合片段可以使用蛋白酶獲得(例如，整個(gè)抗體用木瓜蛋白酶消化得到fab片段，用胃蛋白酶消化得到f(ab')2片段)，可以通過基因重組技術(shù)制備。

34、本公開的免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如，igg、ige、igm、igd、iga、igy等)或亞類(例如，iggl、igg2、igg3、igg4、igg5、iga1、iga2等)。

35、在抗體或抗體片段中，除了cdr或可變區(qū)之外的部分(例如恒定區(qū))可以衍生自人抗體，特別地，它們可以衍生自igg、iga、igd、ige、igm或ig?y，例如igg1、igg2、igg3或igg4。

36、抗體或抗原結(jié)合片段可以是化學(xué)或重組合成的(非天然存在的)。

37、4-1bb靶向部分

38、抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體可以包含抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段作為4-1bb靶向部分。

39、術(shù)語“4-1bb”，也稱為cd137或tnfrsf9(tnf受體超家族成員9)，是tnf受體超家族(tnfrsf)的成員，并且是一種共刺激分子，其在免疫細(xì)胞(固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞兩者)活化后表達(dá)。4-1bb在調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞的活性中起重要作用。如本文所用，4-1bb可以源自哺乳動(dòng)物，例如智人(homo?sapiens)(人)(ncbi登錄號(hào)np_001552.2)。例如，人4-1bb蛋白(np_001552.2)可以由氨基酸序列(seq?id?no：89)表示，如下所示：

40、1???mgnscyniva?tlllvlnfer?trslqdpcsn?cpagtfcdnn?rnqicspcpp?nsfssaggqr

41、61??tcdicrqckg?vfrtrkecss?tsnaecdctp?gfhclgagcs?mceqdckqgq?eltkkgckdc

42、121?cfgtfndqkr?gicrpwtncs?ldgksvlvng?tkerdvvcgp?spadlspgas?svtppapare

43、181?pghspqiisf?flaltstall?fllffltlrf?svvkrgrkkl?lyifkqpfmr?pvqttqeedg

44、241?cscrfpeeee?ggcel

45、在一種實(shí)施方式中，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：

46、cdr(互補(bǔ)決定區(qū))-h1(h-cdr1)，其包含seq?id?no:1、2或3的氨基酸序列；

47、h-cdr2，其包含seq?id?no：4、5或6的氨基酸序列；

48、h-cdr3，其包含seq?id?no：7、8、9、10或11的氨基酸序列；

49、l-cdr1，其包含seq?id?no：12或13的氨基酸序列；

50、l-cdr2，其包含seq?id?no：14或15的氨基酸序列；和

51、l-cdr3，其包含seq?id?no：16或17的氨基酸序列。

52、抗4-1bb抗體或抗原結(jié)合片段的cdr的氨基酸序列如表1所示：

53、[表1]

54、

55、例如，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：

56、含有seq?id?no：1的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：4的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：7的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:12的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:14的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:16的氨基酸序列的l-cdr3；

57、含有seq?id?no：1的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：4的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：8的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:12的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:14的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:16的氨基酸序列的l-cdr3；

58、含有seq?id?no：1的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：4的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：9的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:12的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:14的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:16的氨基酸序列的l-cdr3；

59、含有seq?id?no：1的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：4的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：7的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:15的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:17的氨基酸序列的l-cdr3；

60、含有seq?id?no：1的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：4的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：8的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:15的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:17的氨基酸序列的l-cdr3；

61、含有seq?id?no：1的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：4的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：9的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:15的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:17的氨基酸序列的l-cdr3；

62、含有seq?id?no：2的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：5的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：10的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:12的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:14的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:16的氨基酸序列的l-cdr3；

63、含有seq?id?no：2的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：5的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：10的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:15的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:17的氨基酸序列的l-cdr3；

64、含有seq?id?no：3的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：6的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：11的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:12的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:14的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:16的氨基酸序列的l-cdr3；或

65、含有seq?id?no：3的氨基酸序列的h-cdr1，含有seq?id?no：6的氨基酸序列的h-cdr2，含有seq?id?no：11的氨基酸序列的h-cdr3，含有seq?id?no:13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:15的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:17的氨基酸序列的l-cdr3。

66、另一種實(shí)施方式中，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：重鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no:1、2或3的氨基酸序列的h-cdr1、含有seq?id?no:4、5或6的氨基酸序列的h-cdr2和含有seq?id?no:7、8、9、10或11的氨基酸序列的h-cdr3；和輕鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no:12或13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:14或15的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:16或17的氨基酸序列的l-cdr3。

67、在另一種實(shí)施方式中，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：重鏈可變區(qū)，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：30、31、32、33、34或88的氨基酸序列。

68、抗4-1bb抗體或抗原結(jié)合片段的可變區(qū)的氨基酸序列如表2所示：

69、[表2]

70、

71、

72、

73、例如，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：

74、含有seq?id?no:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含有seq?id?no：30的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

75、含有seq?id?no:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含有seq?id?no：31的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

76、含有seq?id?no:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含有seq?id?no：32的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

77、含有seq?id?no:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含有seq?id?no：33的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；

78、含有seq?id?no:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含有seq?id?no：34的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或

79、含有seq?id?no:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含有seq?id?no：88的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

80、抗4-1bb抗體或抗原結(jié)合片段的可變區(qū)的框架的氨基酸序列如表3所示：

81、[表3]

82、

83、

84、

85、在另一種實(shí)施方式中，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：56、57、58、59、60或61的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：62、63或64的氨基酸序列。例如，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：

86、重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：56、57、58、59、60或61的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：62的氨基酸序列；

87、重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：56、57、58、59、60或61的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：63的氨基酸序列；或

88、重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：56、57、58、59、60或61的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：64的氨基酸序列。

89、在另一種實(shí)施方式中，抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段可以是scfv(單鏈可變片段)，所述scfv包括：

90、重鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no：1、2或3的氨基酸序列的h-cdr1、含有seq?idno：4、5或6的氨基酸序列的h-cdr2、和含有seq?id?no:7、8、9、10或11的氨基酸序列的h-cdr3；和

91、輕鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no：12或13的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?idno：14或15的氨基酸序列的l-cdr2、和含有seq?id?no:16或17的氨基酸序列的l-cdr3，

92、其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以以任何順序直接(即，無接頭地)或通過肽接頭彼此連接。

93、例如，抗4-1bb?scfv可包括：

94、重鏈可變區(qū)，其包含seq?id?no：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列；和

95、輕鏈可變區(qū)，其包含seq?id?no：30、31、32、33、34或88的氨基酸序列或基本上由seq?id?no：30、31、32、33、34或88的氨基酸序列組成，

96、其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以以任何順序直接或通過肽接頭彼此連接。

97、例如，抗4-1bb?scfv可包括：

98、重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：24、25、26、27、28或29的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：33的氨基酸序列；

99、重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：24、25、26、27、28或29的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：34的氨基酸序列；或

100、重鏈可變區(qū)，包含seq?id?no:24、25、26、27、28或29的氨基酸序列；以及輕鏈可變區(qū)，包含seq?id?no：88的氨基酸序列，

101、其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以以任何順序直接或通過肽接頭彼此連接。

102、在本公開中，抗4-1bb?scfv以任意順序包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。例如，抗4-1bb?scfv可以在從n端到c端的方向上包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)?？商娲兀?-1bbscfv可以在從n端到c端的方向上包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

103、her2靶向部分

104、抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體可以包含抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段作為her2靶向部分。

105、“her2(人表皮生長(zhǎng)因子受體2)”由erbb2基因編碼，是表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr/erbb)的成員。已知her2在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。特別是，當(dāng)與細(xì)胞外生長(zhǎng)因子結(jié)合時(shí)，它具有與其他her受體一起組裝成同源和/或異源二聚體的強(qiáng)烈趨勢(shì)，這導(dǎo)致數(shù)種形式的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、存活或細(xì)胞增殖。例如，her2蛋白可以是以genbank登錄號(hào)np_004439.2、np_001005862.1等保藏的多肽，其分別由以genbank登錄號(hào)nm004448.4、nm_001005862.3等保藏的核苷酸序列(mrna)編碼。

106、在一種實(shí)施方式中，抗her2抗體可以選自由曲妥珠單抗、帕妥珠單抗和曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物(trastuzumab?emtansine)(t-dm1)組成的組。

107、將her2識(shí)別為抗原的抗her2抗體的抗原結(jié)合區(qū)可以是選自由曲妥珠單抗、帕妥珠單抗和曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物(t-dm1)組成的組中的抗her2抗體的scfv、(scfv)2、fab、fab'或f(ab')2。

108、抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可以是抗her2抗體或其包含曲妥珠單抗、帕妥珠單抗或曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物(t-dm1)的6個(gè)cdr的抗原結(jié)合片段。

109、在一種實(shí)施方式中，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可以是曲妥珠單抗或其抗原結(jié)合片段，或其變體。

110、例如，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：

111、h-cdr1，其包含seq?id?no：65的氨基酸序列；

112、h-cdr2，其包含seq?id?no：66的氨基酸序列；

113、h-cdr3，其包含seq?id?no：67的氨基酸序列；

114、l-cdr1，其包含seq?id?no：68的氨基酸序列；

115、l-cdr2，其包含seq?id?no：69的氨基酸序列；和

116、l-cdr3，其包含seq?id?no：70的氨基酸序列。

117、抗her2抗體或抗原結(jié)合片段的cdr的氨基酸序列如表4所示：

118、[表4]

119、

120、另一種實(shí)施方式中，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：重鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no:65的氨基酸序列的h-cdr1、含有seq?id?no:66的氨基酸序列的h-cdr2和含有seq?id?no:67的氨基酸序列的h-cdr3；和輕鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no:68的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no:69的氨基酸序列的l-cdr2和含有seq?id?no:70的氨基酸序列的l-cdr3。在另一種實(shí)施方式中，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：重鏈可變區(qū)，包含seq?id?no：71的氨基酸序列或基本上由seq?id?no：71的氨基酸序列組成：和輕鏈可變區(qū)，包含seq?id?no：72的氨基酸序列或基本上由seq?id?no：72的氨基酸序列組成。

121、抗her2抗體或抗原結(jié)合片段的可變區(qū)的氨基酸序列如表5所示：

122、[表5]

123、

124、在另一種實(shí)施方式中，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可包含：重鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：73或74的氨基酸序列；和輕鏈，包含以下或基本上由以下組成：seq?id?no：75的氨基酸序列。在另一種實(shí)施方式中，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可以是scfv(單鏈可變片段)，所述scfv包括：

125、重鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no：65的氨基酸序列的h-cdr1、含有seq?id?no：66的氨基酸序列的h-cdr2、和含有seq?id?no:67的氨基酸序列的h-cdr3；和

126、輕鏈可變區(qū)，包含：含有seq?id?no：68的氨基酸序列的l-cdr1、含有seq?id?no：69的氨基酸序列的l-cdr2、和含有seq?id?no:70的氨基酸序列的l-cdr3，

127、其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以以任何順序直接(即，無接頭地)或通過肽接頭彼此連接。

128、在另一種實(shí)施方式中，抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段可以是scfv(單鏈可變片段)，所述scfv包括：

129、重鏈可變區(qū)，其包含seq?id?no：71的氨基酸序列或基本上由seq?id?no：71的氨基酸序列組成；和

130、輕鏈可變區(qū)，其包含seq?id?no：72的氨基酸序列或基本上由seq?id?no：72的氨基酸序列組成，

131、其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以以任何順序直接或通過肽接頭彼此連接。

132、在本公開中，抗her2?scfv以任意順序包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。例如，抗her2?scfv可以在從n端到c端的方向上包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。可替代地，抗her2scfv可以在從n端到c端的方向上包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

133、雙特異性抗體

134、本公開提供了抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體，該抗體包含：

135、(1)作為her2靶向部分的抗her2抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性識(shí)別和/或結(jié)合her2蛋白；和

136、(2)作為4-1bb靶向部分的抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性識(shí)別和/或結(jié)合4-1bb蛋白。

137、抗her2/抗4-1bb雙特異性抗體可僅在與表達(dá)her2的腫瘤細(xì)胞交聯(lián)時(shí)活化4-1bb信號(hào)傳導(dǎo)。此外，雙特異性抗體中所包含的抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段的特征可以是，僅在腫瘤微環(huán)境(tme)中定位和/或激活，和/或與現(xiàn)有的抗4-1bb抗體相比顯著地降低肝臟毒性，同時(shí)維持免疫應(yīng)答增強(qiáng)和/或腫瘤治療的功效。

138、在一種實(shí)施方式中，雙特異性抗體可以包含全長(zhǎng)抗her2抗體和抗4-1bb抗體的抗原結(jié)合片段(例如，scfv)，其中抗4-1bb抗體的抗原結(jié)合片段可以直接或通過肽接頭與全長(zhǎng)抗her2抗體的n-末端、c-末端或其兩者連接。在另一種實(shí)施方式中，雙特異性抗體可以包含全長(zhǎng)抗4-1bb抗體和抗her2抗體的抗原結(jié)合片段(例如，scfv)，其中抗her2抗體的抗原結(jié)合片段可以直接或通過肽接頭與全長(zhǎng)抗4-1bb抗體的n-末端、c-末端或其兩者連接。

139、在一種實(shí)施方式中，雙特異抗體中所包含的scfv可以任意順序包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。例如，雙特異性抗體中所包含的scfv可以在從n端到c端的方向上包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，以及任選地包含在它們之間的肽接頭，或者可替代地，雙特異性抗體中所包含的scfv可以在從n端到c端的方向上包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，以及任選地包含在它們之間的肽接頭。

140、當(dāng)雙特異性抗體包括全長(zhǎng)抗her2抗體和抗4-1bb?scfv時(shí)，雙特異性抗體可以包括：

141、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

142、抗her2抗體的重鏈，

143、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

144、抗4-1bb?scfv；和

145、(ii)第二多肽，包含抗her2抗體的輕鏈，

146、其中抗4-1bb?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

147、抗4-1bb抗體的輕鏈可變區(qū)，

148、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

149、抗4-1bb抗體的重鏈可變區(qū)。

150、可替代地，雙特異性抗體可包括：

151、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

152、抗4-1bb?scfv，

153、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

154、抗her2抗體的重鏈；和

155、(ii)第二多肽，包含抗her2抗體的輕鏈，

156、其中抗4-1bb?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

157、抗4-1bb抗體的輕鏈可變區(qū)，

158、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

159、抗4-1bb抗體的重鏈可變區(qū)。

160、可替代地，雙特異性抗體可包括：

161、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

162、抗her2抗體的重鏈，

163、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

164、抗4-1bb?scfv；和

165、(ii)第二多肽，包含抗her2抗體的輕鏈，

166、其中抗4-1bb?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

167、抗4-1bb抗體的重鏈可變區(qū)，

168、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

169、抗4-1bb抗體的輕鏈可變區(qū)。

170、可替代地，雙特異性抗體可包括：

171、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

172、抗4-1bb?scfv，

173、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

174、抗her2抗體的重鏈；和

175、(ii)第二多肽，包含抗her2抗體的輕鏈，

176、其中抗4-1bb?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

177、抗4-1bb抗體的重鏈可變區(qū)，

178、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

179、抗4-1bb抗體的輕鏈可變區(qū)。

180、當(dāng)雙特異性抗體包括全長(zhǎng)抗4-1bb抗體和抗her2?scfv時(shí)，雙特異性抗體可以包括：

181、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

182、抗4-1bb抗體的重鏈，

183、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

184、抗her2?scfv；和

185、(ii)第二多肽，包含抗4-1bb抗體的輕鏈，

186、其中抗her2?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

187、抗her2抗體的輕鏈可變區(qū)，

188、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

189、抗her2抗體的重鏈可變區(qū)。

190、可替代地，雙特異性抗體可包括：

191、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

192、抗her2?scfv，

193、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

194、抗4-1bb抗體的重鏈；和

195、(ii)第二多肽，包含抗4-1bb抗體的輕鏈，

196、其中抗her2?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

197、抗her2抗體的輕鏈可變區(qū)，

198、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

199、抗her2抗體的重鏈可變區(qū)。

200、可替代地，雙特異性抗體可包括：

201、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

202、抗4-1bb抗體的重鏈，

203、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

204、抗her2?scfv；和

205、(ii)第二多肽，包含抗4-1bb抗體的輕鏈，

206、其中抗her2?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

207、抗her2抗體的重鏈可變區(qū)，

208、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

209、抗her2抗體的輕鏈可變區(qū)。

210、可替代地，雙特異性抗體可包括：

211、(i)第一多肽，在從n端到c端的方向上包含：

212、抗her2?scfv，

213、任選地，肽接頭(第一肽接頭)，和

214、抗4-1bb抗體的重鏈；和

215、(ii)第二多肽，包含抗4-1bb抗體的輕鏈，

216、其中抗her2?scfv可在從n端到c端的方向上包含：

217、抗her2抗體的重鏈可變區(qū)，

218、任選地，肽接頭(第二肽接頭)，和

219、抗her2抗體的輕鏈可變區(qū)。

220、第一肽接頭和第二肽接頭可以在雙特異性抗體中獨(dú)立地存在或不存在，并且彼此相同或不同。

221、在另一種實(shí)施方式中，雙特異性抗體中所包含的her2靶向部分和4-1bb靶向部分兩者都可以是全長(zhǎng)抗體或包含直接或通過肽接頭相互連接的重鏈cdr、輕鏈cdr或其組合的抗原結(jié)合片段。

222、假設(shè)每種抗體都可以結(jié)合4-1bb(例如人4-1bb)和her2(例如人her2)兩者，可以將本文所公開的cdr序列或vh(重鏈可變區(qū))和vl(輕鏈可變區(qū))序列“混合并匹配”以產(chǎn)生其他的抗her2/抗4-1bb結(jié)合雙特異性分子。

223、肽接頭

224、對(duì)于高純度抗體，雙特異性抗體可以包含在第一多肽中的重鏈和scfv之間的肽接頭(第一肽接頭)，和/或在scfv中的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的肽接頭(第二肽接頭)。

225、如本文所用，術(shù)語“肽接頭”可以指包括1至100個(gè)氨基酸，特別是2至50個(gè)氨基酸的寡肽，每個(gè)氨基酸可以是任何種類的氨基酸，而沒有任何限制?？梢栽谟谢驔]有適當(dāng)修飾的情況下使用任何常規(guī)的肽接頭以符合特定目的。在具體的實(shí)施方式中，肽接頭可包含例如gly、asn和/或ser殘基，和/或包含中性氨基酸如thr和/或ala。適用于肽接頭的氨基酸序列可以是相關(guān)領(lǐng)域已知的。肽接頭的長(zhǎng)度可以在不影響多肽和/或scfv功能的限度內(nèi)適當(dāng)確定。例如，肽接頭可通過包括總共約1至約100個(gè)氨基酸、約2至約50個(gè)氨基酸或約5至約25個(gè)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè))氨基酸而形成，每個(gè)氨基酸獨(dú)立地選自由gly、asn、ser、thr和ala組成的組。在一種實(shí)施方式中，肽接頭可以表示為(gms1)n(m、l和n分別是“g”、“s”和“(gms1)”的數(shù)量，并且獨(dú)立地選自約1至約10，特別是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一種實(shí)施方式中，肽接頭可以是(ggggs)2、(ggggs)3、(ggggs)4或(gs)9的氨基酸，但不限于此。

226、醫(yī)學(xué)用途

227、提供了雙特異性抗體用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或治療和/或預(yù)防癌癥的醫(yī)學(xué)用途。

228、更具體地，一實(shí)施方式提供了包含雙特異性抗體作為活性成分的藥物組合物。該藥物組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，和/或用于治療和/或預(yù)防癌癥。

229、另一種實(shí)施方式提供了用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述組合物包含雙特異性抗體作為活性成分。

230、另一種實(shí)施方式提供了一種在有需要的受試者中治療和/或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括將藥學(xué)有效量的雙特異性抗體或藥物組合物施用至受試者。該方法可以進(jìn)一步具有在施用步驟之前鑒定需要治療和/或預(yù)防癌癥的受試者的步驟。

231、另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體或藥物組合物用于治療和/或預(yù)防癌癥的用途。另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。

232、在一些實(shí)施方式中，癌癥的特征可以是her2表達(dá)或her2過表達(dá)(與正常相比)。

233、另一種實(shí)施方式提供了用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的藥物組合物，所述組合物包含雙特異性抗體作為活性成分。

234、另一種實(shí)施方式提供了一種在有需要的受試者中增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將藥學(xué)有效量的雙特異性抗體或藥物組合物施用至受試者。該方法可以進(jìn)一步包括在施用步驟之前鑒定需要增強(qiáng)免疫應(yīng)答的受試者的步驟。

235、另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體或藥物組合物用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途。另一種實(shí)施方式提供了雙特異性抗體在制備用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的藥物中的用途。

236、在一些實(shí)施方式中，雙特異性抗體或藥物組合物可以在存在her2的條件下增強(qiáng)免疫應(yīng)答。例如，在增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法中，受試者可以具有表達(dá)her2或過表達(dá)her2的細(xì)胞(例如，表達(dá)her2或過表達(dá)her2的癌細(xì)胞)。

237、雙特異性抗體或藥物組合物所預(yù)防和/或治療的癌癥可能與4-1bb和/或her2，尤其是her2表達(dá)或her2過表達(dá)的癌癥有關(guān)。癌癥可以選自實(shí)體癌和血癌。所述癌癥可以是但不限于選自由乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌(例如，肺鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌)、腹膜癌、皮膚癌、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚或眼球黑色素瘤、直腸癌、肛門附近的癌癥、食道癌、小腸腫瘤、內(nèi)分泌腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌癥、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、肝癌、胃腸道癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞腺瘤、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺腫瘤、腎癌、宮頸癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、腦癌、膽道癌、膽囊癌等組成的組中的一種或多種。癌癥可以是原發(fā)性癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥。

238、如本文所用，術(shù)語“癌癥的預(yù)防和/或治療”可以指癌細(xì)胞死亡、癌細(xì)胞增殖的抑制、與癌癥相關(guān)的癥狀的緩解、癌癥轉(zhuǎn)移的抑制等。

239、如本文所用，術(shù)語“免疫應(yīng)答的增強(qiáng)”可以指4-1bb信號(hào)激活、與4-1bb相關(guān)的任何免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，例如4-1bb誘導(dǎo)的信號(hào)活化(例如，4-1bb誘導(dǎo)的nf-kb信號(hào)活化)、細(xì)胞因子釋放增加、諸如t細(xì)胞的免疫細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞等，但不限于此。在一些實(shí)施方式中，本公開提供的雙特異性抗體對(duì)免疫應(yīng)答的增強(qiáng)可以在her2的存在下發(fā)生。

240、除了作為活性成分的雙特異性抗體之外，藥物組合物還可包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑可以是選自常用于配制抗體的那些中的任何一種。例如，藥學(xué)上可接受的載體可以是選自由乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油組成的組中的一種或多種，但不限于此。

241、藥物組合物還可包含選自由潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、甜味劑、增味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等組成的組中的一種或多種。

242、雙特異性抗體或藥物組合物可以口服或經(jīng)非胃腸道施用至受試者。非腸胃道施用可以是靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、內(nèi)皮施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用或直腸施用。由于口服施用導(dǎo)致蛋白質(zhì)或肽被消化，因此必須將用于口服施用的組合物中的活性成分包衣或配制以防止在胃中消化。另外，可以使用使活性成分能夠遞送至靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的任選裝置來施用組合物。

243、如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)有效量”可以指活性成分雙特異性抗體可以在預(yù)防或治療癌癥中發(fā)揮藥學(xué)上有意義的作用的量。雙特異性抗體的藥學(xué)有效量，或由雙特異性抗體的量指示的藥物組合物的合適劑量，可以取決于各種因素以各種方式規(guī)定，例如患者的年齡、體重、性別、病理狀況、飲食、排泄速度和/或反應(yīng)敏感性、劑型、施用時(shí)間、施用途徑、施用方式等。例如，雙特異性抗體的藥學(xué)有效量或藥物組合物的成人合適劑量可以在每天約0.001至約1000mg(雙特異性抗體的量)/kg(體重)、約0.01至約100mg/kg、或0.1至50mg/kg的范圍內(nèi)。

244、施用雙特異性抗體或藥物組合物的受試者可以是選自哺乳動(dòng)物中的一種，例如人、猴、大鼠、小鼠、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等，或由其獲得的細(xì)胞或組織，但不限于此，它可以是患有癌癥的受試者。

245、藥物組合物可以與藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑通過本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實(shí)施的方法配制成單位劑型或多次劑型。劑型可以是油溶液或水性介質(zhì)、混懸劑、糖漿、乳化溶液、提取物、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑，并且可以進(jìn)一步包括分散劑或穩(wěn)定劑。

246、多核苷酸、重組載體和抗體的制備

247、一種實(shí)施方式提供了編碼雙特異性抗體的多核苷酸。例如，多肽可包含：編碼直接連接或通過肽接頭連接的本文所述的抗her2抗體的重鏈和本文所述的抗4-1bb抗體的scfv的第一多核苷酸；以及編碼抗her2抗體的輕鏈的第二多核苷酸?？商娲?，多肽可包含：編碼直接連接或通過肽接頭連接的本文所述的抗4-1bb抗體的重鏈和本文所述的抗her2抗體的scfv的第一多核苷酸；以及編碼抗4-1bb抗體的輕鏈的第二多核苷酸。

248、另一種實(shí)施方式提供了包含多核苷酸的載體。例如，重組載體可以包含一起在一個(gè)載體中或分別在兩個(gè)載體中的第一多核苷酸和第二多核苷酸。另一種實(shí)施方式提供了包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的重組細(xì)胞。例如，重組細(xì)胞可以是用重組載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

249、另一種實(shí)施方式提供了制備雙特異性抗體的方法，包括在細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸，例如第一多核苷酸和第二多核苷酸。表達(dá)多核苷酸的步驟可以通過在允許多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸(例如該多核苷酸在重組載體中)的細(xì)胞來進(jìn)行。該方法可以進(jìn)一步包括在表達(dá)或培養(yǎng)步驟之后，從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和/或純化抗4-1bb抗體或其抗原結(jié)合片段。

250、術(shù)語“載體”是指用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)靶基因的工具，例如質(zhì)粒載體、粘粒載體和病毒載體，例如噬菌體載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。重組載體可以由本領(lǐng)域常用的質(zhì)粒(例如psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19)、噬菌體(例如λgt4λb、λ-charon、λδz1和m13)或通過操縱病毒(例如sv40等)來構(gòu)建。

251、在重組載體中，多核苷酸可以可操作地連接至啟動(dòng)子。術(shù)語“可操作地連接”旨在涉及靶核苷酸序列與表達(dá)調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子序列)之間的功能性連接。當(dāng)“可操作地連接”時(shí)，調(diào)節(jié)元件可以控制靶核苷酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

252、通常可以將重組載體構(gòu)建為克隆載體或表達(dá)載體。對(duì)于重組表達(dá)載體，可以使用相關(guān)領(lǐng)域通?？捎糜谠谥参铩?dòng)物或微生物細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白質(zhì)的載體。本領(lǐng)域熟知的各種方法可用于構(gòu)建重組載體。

253、為了在宿主如原核或真核細(xì)胞中使用，可以相應(yīng)地構(gòu)建重組載體。例如，當(dāng)將載體構(gòu)建為用于原核宿主中的表達(dá)載體時(shí)，該載體通常包括用于轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如plκλ啟動(dòng)子，cmv啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，t7啟動(dòng)子等)，用于起始翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。另一方面，用于真核宿主的表達(dá)載體包括真核細(xì)胞中可操作的復(fù)制起點(diǎn)，例如f1復(fù)制起點(diǎn)、sv40復(fù)制起點(diǎn)、pmb1復(fù)制起點(diǎn)、腺病毒復(fù)制起點(diǎn)(adenoorigin?of?replication)、aav復(fù)制起點(diǎn)和bbv復(fù)制起點(diǎn)，但不限于此。另外，表達(dá)載體通常包括源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或源自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子、牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和hsv的tk啟動(dòng)子)以及作為轉(zhuǎn)錄終止序列的聚腺苷酸化序列。

254、可以通過將重組載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中來制備重組細(xì)胞。在本公開中可以使用本領(lǐng)域已知的任何宿主細(xì)胞，只要該細(xì)胞允許以穩(wěn)定的方式順序克隆和表達(dá)重組載體。可用于本公開的原核宿主細(xì)胞的實(shí)例選自大腸桿菌、芽孢桿菌屬、例如枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)和蘇云金芽孢桿菌(bacillus?thuringiensis)，以及腸桿菌科菌株例如鼠傷寒沙門氏菌(salmonella?typhimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(serratia?marcescens)和各種假單胞菌屬物種?？捎糜谵D(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞可選自但不限于啤酒酵母(saccharomyce?cerevisiae)、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，例如sp2/0、cho(中國(guó)倉鼠卵巢)-k1、cho?dg44、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rin和mdck。

255、可以使用相關(guān)領(lǐng)域熟知的方法將多核苷酸或攜帶該多核苷酸的重組載體導(dǎo)入(轉(zhuǎn)染)到宿主細(xì)胞中。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞時(shí)，可以使用cacl2或電穿孔方法進(jìn)行此轉(zhuǎn)染。對(duì)于真核宿主細(xì)胞，可以使用但不限于顯微注射、磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或顆粒轟擊來實(shí)現(xiàn)遺傳導(dǎo)入。

256、為了選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法利用與選擇標(biāo)記相關(guān)的表型。例如，當(dāng)選擇標(biāo)記是賦予對(duì)特定抗生素抗性的基因時(shí)，宿主細(xì)胞可以在培養(yǎng)基中存在抗生素的情況下生長(zhǎng)，從而選擇了目的轉(zhuǎn)化體。

257、另一種實(shí)施方式提供了生產(chǎn)雙特異性抗體的方法，該方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸或重組載體的步驟。在一種實(shí)施方式中，生產(chǎn)方法可包括培養(yǎng)攜帶有多核苷酸或重組載體的重組細(xì)胞，并任選地從培養(yǎng)基中分離和/或純化抗體。

258、有益效果

259、本公開涉及雙特異性抗體及其用途，所述雙特異性抗體中的每一種都包括對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(taa；her2)特異的抗體和對(duì)4-1bb特異的抗體。這些雙特異性抗體僅在存在her2表達(dá)細(xì)胞的情況下活化4-1bb信號(hào)傳導(dǎo)并增強(qiáng)強(qiáng)免疫細(xì)胞。由于特異性her2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，預(yù)計(jì)與4-1bb單克隆抗體相比，使用雙特異性抗體的肝毒性要小得多。