本發(fā)明屬于生物檢測，尤其涉及一種基于crispr-cas13a系統(tǒng)的雙通道同時檢測血清中ape1酶和mirna的試劑盒和應用。

背景技術(shù)：

1、癌癥相關(guān)生物標志物的靈敏檢測對癌癥的臨床早期篩查和預后評估具有重要意義。生物標志物一般可分為酶、核酸和小分子代謝物。micrornas(mirnas)是一類很重要的核酸生物標志物，長度為18～25個堿基，在翻譯水平發(fā)揮關(guān)鍵作用并調(diào)控基因表達，是重要的內(nèi)源性監(jiān)管機構(gòu)。大量研究表明，某些mirnas的異常表達或突變與某些癌癥的發(fā)病機制有關(guān)，這使mirnas成為肺癌、結(jié)直腸癌等疾病早期診斷中很有前景的生物標志物。哺乳動物無嘌呤/無嘧啶內(nèi)切酶1(ape1)是一種dna修復酶，在堿基切除修復過程中，ape1酶通過切割無嘌呤嘧啶(ap)位點來維持基因組穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)ape1含量的變化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，是一種主要的酶類生物標志物；還有研究通過表征ape1與rna和其他蛋白質(zhì)相互作用組，發(fā)現(xiàn)ape1在mirna前體的加工和穩(wěn)定中起著重要作用，可以調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因pten的表達，ape1的酶活性會直接影響mirna的合成。檢測ape1和mirnas對癌癥的臨床診斷具有重要的現(xiàn)實意義。

2、盡管mirnas和ape1酶在癌癥患者體內(nèi)是高表達的，但是其豐度仍然相對較低，對其進行靈敏檢測存在很大挑戰(zhàn)。為了解決這一問題，研究者們開發(fā)了各種擴增策略來提高mirna的檢測靈敏度，比如，酶活化分子信標、滾動環(huán)擴增、環(huán)介導等溫擴增等酶信號擴增方法。此外，無酶擴增策略，包括核酸酶動態(tài)擴增、雜交鏈反應和催化發(fā)夾自組裝，由于其簡單性、穩(wěn)健性和非酶學特性，已被廣泛用于rna的靈敏檢測。而對于ape1酶的檢測，最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗，為了提高檢測的精準度，還開發(fā)了一些新的檢測方法，如dnazymewalker，dna網(wǎng)絡(luò)，dna機器等。

3、以上研究都是針對單一生物標志物的單通道信號輸出模式，然而，很多情況下，單一生物標志物的檢測并不能準確反映疾病的發(fā)生發(fā)展情況。而且很多生物標志物在正常細胞和癌癥細胞內(nèi)都有表達，只是在癌癥細胞內(nèi)相對高表達，這使得以單一生物標志物為檢測物的系統(tǒng)容易出現(xiàn)假陽性和脫靶檢測的風險。因此，為了提高癌癥診斷的精準性，需要同時對多種生物標志物進行分析。鑒于ape1和mirnas在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)聯(lián)性，ape1和mirnas常被同時用作關(guān)鍵靶標。比如，研究者將dna邏輯門策略用于癌癥細胞中ape1和mirnas的成像研究，盡管在提高癌癥檢測準確性方面取得了一些進展。但是，dna邏輯門的信號放大功能有限，信號輸出模式單一，當目標癌細胞中兩種輸入標志物的表達水平不一致時，信號的敏感性將受到損害。因此，開發(fā)具有信號放大功能的雙信號輸出模式，且能夠同時高靈敏和特異性檢測這兩種生物標志物的檢測方法迫在眉睫。

4、近年來，crispr/cas系統(tǒng)已廣泛應用于生物醫(yī)學研究和臨床診斷。在這些系統(tǒng)中，cas13a，是一種rna引導的核糖核酸酶，其在目標rna存在的情況下，能夠非特異性地切割附近的rna(稱為反式切割)。這種被單個靶核酸激活的反式切割活性可以在生理溫度下切割大量非特異性核酸鏈，產(chǎn)生信號放大的效果。更重要的是，與之前報道的信號放大策略相比，比如，雜交鏈式反應、催化發(fā)夾自組裝和dna納米機器等，crispr/cas系統(tǒng)的使用在提高檢測靈敏度的同時，還可以大大降低核酸序列的設(shè)計難度。

5、為了實現(xiàn)癌癥特異性診斷的目的，我們利用crispr-cas13a的檢測特性開發(fā)了一種能夠同時用于ape1與mirnas的雙通道檢測試劑盒，具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服以上背景技術(shù)中提到的不足和缺陷，鑒于mirna與ape1之間在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)聯(lián)性，結(jié)合crispr-cas13a蛋白的檢測特性，提供一種基于crispr-cas13a系統(tǒng)雙通道同時檢測ape1酶和mirna的試劑盒。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：

3、一種雙鏈，其為帶有ap位點(無嘌呤嘧啶位點)的dna鏈與crispr-cas13a的crrna退火雜交形成的雙鏈；所述dna鏈上修飾有猝滅基團1，所述crrna上修飾有熒光基團1，退火雜交形成的雙鏈上的熒光被完全猝滅。猝滅基團和熒光基團修飾在5’端或3’端均可。

4、上述的雙鏈，優(yōu)選的，所述dna鏈與crrna的摩爾濃度比例為1:1～1:5，例如可以為1:1、1:2或1:3，能夠?qū)晒饣鶊F的熒光完全猝滅的比例均可。

5、優(yōu)選的，所述dna鏈的ap位點數(shù)量為1～5個，分布在dna鏈上，所述dna鏈的長度為24nt～40nt，以使所述dna鏈與crrna雜交后，能夠使crispr-cas13a完全失去核酸靶向能力。dna鏈的長度，ap位點的數(shù)量和位置將直接對背景信號、兩種靶標的檢測速率與檢測限產(chǎn)生影響。

6、更優(yōu)選的，所述dna鏈的核苷酸序列可以是：5’-caagtcac/idsp/agtggtt/idsp/cgtgttt-3’、5’-caagtc/idsp/ctagtggttc/idsp/gtgttt-3’、5’-caagt/idsp/actagt/id?sp/gttccgtgttt-3’、5’-caagt/idsp/actagt/idsp/gttcc/idsp/tgttt-3’、5’-caagtc/idsp/ctagtg/idsp/ttccgt/idsp/tttta-3’、5’-caagtca/idsp/tagtggt/idsp/ccgtgtt/idsp/tagt-3’等。

7、優(yōu)選的，所述crrna的核苷酸序列為5’-gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaa?c(n)n-3’，其中，“n”的部分為被檢測的任意一條mirna的互補序列，n≥20nt。例如可以是5’-gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacacggaaccacuagugacuug-3’、5’-gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacaacuauacaaucuacuaccuca-3’、5’-gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaaccacaaauucgguucuacagggua-3’、5’-gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacucaacaucagucugauaagcua-3’、5’-gaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacaccccuaucacgauuagcauuaa-3’等。

8、優(yōu)選的，所述雙鏈由帶有ap位點的dna鏈與crispr-cas13a的crrna通過退火雜交后得到；所述退火雜交的反應條件如下：在pcr緩沖溶液中，在75～95℃下加熱，然后每隔1min降2～5℃，直至25～30℃，最終冷卻至室溫。帶有ap位點的dna鏈與crispr-cas13a的crrna退火雜交后，熒光猝滅，crispr-cas13a的crrna失去識別靶標rna的能力，crispr-cas13a系統(tǒng)暫時失活。

9、基于一個總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種雙通道同時檢測ape1酶和mirna的cris?pr-cas13a檢測試劑盒，其組分包含：上述的帶有ap位點的dna鏈與crispr-cas13a的crrna退火雜交形成的雙鏈、crispr-cas13a蛋白和rna報告探針，所述rna報告探針上修飾有熒光基團2和猝滅基團2，且rna報告探針上的熒光被完全猝滅。

10、rna報告探針上的猝滅基團與熒光基團分別修飾在探針的兩端。rna報告探針的核苷酸序列不做限定，例如可以為uuuuuu。

11、優(yōu)選的，所述ape1酶和mirna雙通道檢測試劑盒中還包含：緩沖溶液和無菌無酶水。

12、優(yōu)選的，所述ape1酶和mirna雙通道檢測試劑盒中，帶有ap位點的dna鏈與crispr-cas13a的crrna退火雜交形成的雙鏈的終濃度為10～100nm，crispr-cas13a蛋白的終濃度為20nm～200nm，rna報告探針的終濃度為200～800nm，其余為1×neb4.0緩沖溶液和無菌無酶水。

13、本發(fā)明的上述熒光基團為fam、cy3、cy5、hex、joe、quasar?670、quasar?570、rox、tamra、tet和vic中的任意一種或多種；猝滅基團為bhq1、bhq2、dabcyl、eclipse、tamra和mgb中的任意一種或多種；熒光基團能夠被猝滅基團猝滅即可。熒光基團1與熒光基團2為不同的基團，猝滅基團1與猝滅基團2為不同的基團。

14、基于一個總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述ape1酶和mirna雙通道檢測試劑盒在非診斷目的雙通道同時檢測ape1及mirna的應用。

15、上述的應用，優(yōu)選的，應用方法包括如下步驟：將待測樣品與所述的ape1酶和mirna雙通道檢測試劑盒進行反應(37℃反應60min)，檢測熒光信號(采用熒光定量pcr儀)；如果檢測到兩種熒光信號，表明待測樣品中同時存在ape1酶和mirna；如果只檢測到一種熒光信號，表明待測樣品中只存在ape1酶，不存在mirna；如果未檢測到熒光信號，表明待測樣品中不存在ape1酶。

16、本發(fā)明整合了crispr-cas13a系統(tǒng)具有核酸識別與信號放大的功能，開發(fā)出雙通道同時檢測ape1和mirna的試劑盒和應用方法，可以以病人的血清、外泌體、細胞裂解液等體液為研究對象，對其中的ape1酶和mirna進行檢測，也能夠?qū)⒃撓到y(tǒng)導入細胞，進行細胞內(nèi)的雙生物標志物檢測。當待測樣品中存在ape1酶時，ape1酶識別到dna鏈上的ap位點，進而切斷dna鏈，釋放crrna，并產(chǎn)生第一個熒光信號；此時，若存在mirna，crispr-cas13a系統(tǒng)特異性靶向目標mirna，進而觸發(fā)其反式切割活性，非特異性地切割rna報告探針，并產(chǎn)生第二個熒光信號，最終實現(xiàn)ape1和mirna的雙通道同時檢測。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

18、1、本發(fā)明的試劑盒，首次利用crispr-cas13a系統(tǒng)對非核酸靶標ape1和核酸靶標mirnas進行雙通道同時檢測，能夠解決現(xiàn)有crispr技術(shù)難以同時對非核酸類靶標和核酸類靶標的高靈敏度和特異性檢測問題。

19、2、本發(fā)明的試劑盒，用一條帶有ap位點且修飾猝滅基團1的dna鏈與修飾熒光基團1的crispr-cas13a?crrna按一定比例退火雜交形成雙鏈，在crispr-cas13a系統(tǒng)的反應體系中，當目標物ape1存在時，ape1識別dna鏈上的ap位點，dna鏈被切斷，crrna被釋放，產(chǎn)生熒光信號1，達到檢測ape1的目的。同時，crispr-cas13a系統(tǒng)恢復靶向識別的能力，當環(huán)境中存在能夠被系統(tǒng)特異性識別的mirna時，反式切割活性被激活，非特異性地剪切帶有熒光基團2與猝滅基團2的rna報告探針，產(chǎn)生熒光信號2，達到檢測mirna的目的。

20、3、本發(fā)明結(jié)合crispr-cas13a系統(tǒng)的檢測特性，開發(fā)了一種基于crispr-cas13a系統(tǒng)雙通道同時檢測ape1酶和mirna的試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)對ape1與mirna進行高度靈敏且定量檢測。