本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及摩氏摩根氏菌的分型分子標志物及其分型方法和應用。

背景技術：

1、摩氏摩根氏菌（ morganella?morganii，也可稱為摩根摩根菌），為腸桿菌科摩根菌屬兼性厭氧革蘭陰性桿菌，在自然界中廣泛分布，常存在于人及動物的腸道內(nèi)，屬于機會性致病菌，一般引起患者尿路，傷口等部位的感染。根據(jù)是否發(fā)酵海藻糖摩氏摩根氏菌分為 morganella?subsp.?morganii（摩根亞種）和 morganella?subsp.?sibonii（塞諾亞種）兩個亞種。摩氏摩根氏菌具有多種固有耐藥機制，如攜帶ampc酶基因 bladha，對大多數(shù)一代和二代頭孢菌素類，大環(huán)內(nèi)酯類、林克酰胺類、糖肽類、磷霉素、夫西地酸，多黏菌素類和四環(huán)素類天然耐藥。此外，摩氏摩根氏菌還攜帶了種類豐富的獲得性耐藥基因，包括 blakpc-2， blandm， mcr-1和 tet(x3)，是耐藥基因傳播的重要儲存庫。其多重耐藥機制使得摩氏摩根氏菌對抗菌藥物的耐藥率逐年增加，使其成為院內(nèi)感染重要的病原體。隨著摩氏摩根氏菌感染事件的增多，院感爆發(fā)事件也逐漸開始出現(xiàn)。早在20世紀八十年代，tucci和isenberg就報道過在一家醫(yī)院的四個病房中連續(xù)出現(xiàn)13例摩氏摩根氏菌感染事件；懷疑是院感爆發(fā)事件后，醫(yī)院加強院感防控手段，才得以解決這一爆發(fā)事件。

2、在檢測院內(nèi)細菌爆發(fā)事件中，基于多位點序列分型（multilocus?sequencetyping，mlst）是常用的手段，其技術原理是通過測定7個管家基因的序列，并根據(jù)每個位點序列的不同為其分配等位基因號，七個管家基因的等位基因號共同組成了細菌的序列型（sequence?type，st）。然而，在摩氏摩根氏菌中并未建立mlst分型方法。目前，可以對摩氏摩根氏菌全基因組測序分析的方法來研究摩氏摩根氏菌的親緣關系以此來調(diào)查是否發(fā)生院內(nèi)感染。此外，脈沖場凝膠電泳（pfge）也可以用于判斷摩氏摩根氏菌是否屬于同一克隆。其基于大的dna限制性片段在交替極性的電場中的可變遷移的原理，是一種高度區(qū)分性的分子分型技術。還可以通過血清學方法對摩氏摩根氏菌進行分型，摩氏摩根氏菌有34個“o”群和25種“h”抗原，可分66個血清型。最近，bin?liu等人開發(fā)了基于o-抗原的編碼基因wzx和wzy的分子血清學方法，可以把摩氏摩根氏菌分為11種血清型。

3、至今在院內(nèi)感染的常見細菌——摩氏摩根氏菌中，沒有建立一套用于檢測院內(nèi)克隆傳播的分子分型的技術手段，比如對于多位點序列分型而言，目前尚未建立摩氏摩根氏菌的mlst體系；對于全基因組測序分析而言，存在成本較高，周期長，對實驗人員要求也較高，在臨床不易開展等缺點；對于脈沖場凝膠電泳法而言，實驗復雜周期長，對實驗人員要求高，成本較高，重復性差，分辨率低；對于血清學分析法而言，操作難度高，不易觀察結果；對于分子血清學分析法而言，存在部分不攜帶wzx和wzy基因的摩氏摩根氏菌，故此種方法不具有普遍性，因此難以監(jiān)測摩氏摩根氏菌的院內(nèi)爆發(fā)事件，這提示急需一種用于監(jiān)測摩氏摩根氏菌院內(nèi)爆發(fā)的分子分型方法。

技術實現(xiàn)思路

1、根據(jù)現(xiàn)有技術，雖然能夠知曉摩氏摩根氏菌的全基因序列，而全基因序列中包括諸多基因片段，至今并沒有發(fā)現(xiàn)適合對摩氏摩根氏菌進行分型的基因片段和技術方案。

2、為了解決以上問題，本發(fā)明公開了摩氏摩根氏菌的分型分子標志物，以及分型方法和應用，其中， bladha基因作為分子標志物用于摩氏摩根氏菌的分型。本發(fā)明的技術方案簡單，快速，易操作，對實驗人員要求較低，成本較低，便于不同實驗室之間進行比較，對于摩氏摩根氏菌分型的分辨率高，并且對摩氏摩根氏菌的院感監(jiān)測，分子溯源和系統(tǒng)進化分析具有很高優(yōu)勢。

3、為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術方案：

4、本發(fā)明的第一方面提供了一種摩氏摩根氏菌的分型分子標志物，所述分子標志物為 bladha基因或其表達產(chǎn)物，所述 bladha基因的核苷酸序列如seq?id?no.1-31所示。

5、 bladha為摩氏摩根氏菌固有耐藥基因，通常位于摩氏摩根氏菌的染色體中，上游為其調(diào)控基因blaampr，下游為編碼alpha-2-巨球蛋白基因。經(jīng)本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，目前摩氏摩根氏菌的 bladha基因型別包括31種。

6、本領域技術人員應理解，本發(fā)明不以任何方式限制已公開的具體 bladha基因，本發(fā)明包括已知的和將來發(fā)現(xiàn)的人工或自然改變的 bladha基因。

7、本發(fā)明的第二方面提供了一種摩氏摩根氏菌的分型方法，其特征在于，包括如下步驟：

8、(1)?提取待測摩氏摩根氏菌的基因組dna；

9、(2)?將所述待測摩氏摩根氏菌的基因組dna進行擴增；

10、(3)?對擴增產(chǎn)物中的 bladha基因進行測序分析，通過blast比對確定 bladha基因型別。

11、優(yōu)選地，在步驟(1)中通過煮沸法提取待測摩氏摩根氏菌的dna。

12、優(yōu)選地，在步驟(3)中通過blast與seq?id?no:1-31的 bladha型別進行序列比對，確定 bladha基因型別。

13、本發(fā)明的第三方面提供了一種檢測摩氏摩根氏菌分型的引物，所述引物為能夠擴增 bladha基因的序列。

14、在本發(fā)明中，檢測摩氏摩根氏菌分型的引物是根據(jù) bladha基因的上下游片段設計的，上游為其調(diào)控基因blaampr，下游為編碼alpha-2-巨球蛋白基因，可以是能夠擴增所有 bladha基因的序列。

15、其中，上游調(diào)控基因blaampr包含以下序列seq?id?no.32：

16、tatgggtggaaatatgcagatcaatatgcggatggctgtcataaaatccggtcagacgcggcagcagccagcctgcggcaaatgttcccaccgcaccgactttcacccgctcacggaactgcccgtgagaaaaacactccagagtatccgcaatccggtcaaacgcctcattgagcaccggcagtaatccctcaccttcatgggtcagcaccagtccgcgtgagacgcgggtaaacagcacacagccgagttgttcttccagagccctgacctgctggctgacggcggcatgggtgacattcagctcaatcgccgcacgggtaaaactgagatgacgggcggcggcctcaaaggcgcgcagcgggttaagggggagataacgtctgaccataatccacctgtaagtttttctttaggctcttgttataattaaccgtttgttctgtccggtgaatctgacgatacttgccgccgtcactcacacacggaaggttaattctg

17、其中，下游編碼alpha-2-巨球蛋白基因包含以下序列seq?id?no.33：

18、ttttttccctgaacaggcccctgcggatacgccggggccgtaatttaagattattccttatacaataatttgctttatgggctgttttatggaggatgagagtatcgggcactgacagcttccggctgaaccggatttcactgtgtgctgcggcaaactgatgtcagtctcaacacacagaggaaaatgttgtcatggacgttctgcgttttatcctccgcttaccttttattttgctgcgtctggcggctcgcagtcttgtttatctctttactctgctgggttttctgctgcgcccgttcaccggacggatccgctgggcggtgccgggctgggtgacctttgccggtaatcagcttgcccggctggagcggggtgtaaaccgctatccgaaaaccatatctgccttattattgctgactgctgcggtggcagcgggcagttattacacctggcactggtatcagaacaaaccgaagccggtggatgttgcgccgctgg

19、優(yōu)選地，所述引物選自以下引物組中的至少一組：

20、(1)正向引物seq?id?no.34：tgaaggtgatgatttgcggg，

21、反向引物seq?id?no.35：catcctccataaaacagccca；

22、(2)正向引物seq?id?no.36：ctgtttgaagggcagtggac，

23、反向引物seq?id?no.37：caggtgtaataactgcccgc；

24、(3)正向引物seq?id?no.38：cgtgaggccgaaattatgca，

25、反向引物seq?id?no.39：cggccgccacgataataaaa；

26、(4)正向引物seq?id?no.40：gaggccgaaattatgcagca，

27、反向引物seq?id?no.41：agacagacgcgattccagat。

28、本發(fā)明的第四方面提供了 bladha基因或其表達產(chǎn)物在制備用于檢測摩氏摩根氏菌的產(chǎn)品中的應用，其中，所述產(chǎn)品包括試劑、試劑盒、芯片、試紙或測序平臺中的至少一種。

29、本發(fā)明的第五方面提供了一種用于檢測以上所述摩氏摩根氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的引物。

30、優(yōu)選地，本發(fā)明提供了用于檢測摩氏摩根氏菌的試劑盒，所述試劑盒包含摩氏摩根氏菌基因組dna提取液、pcr反應液、pcr引物混合液、陽性對照液和陰性對照液。

31、更優(yōu)選地，所述摩氏摩根氏菌基因組dna提取液包含tris-edta緩沖液，ph=8-8.5；溶菌酶，50-100μg/ml；rna酶10-20μg/ml和蛋白酶k，100-200μg/ml。

32、更優(yōu)選地，所述pcr反應液為2×pcr反應液，其中包含：0.1-0.2u/μl?taq?dna聚合酶；400-500μm?dntp；15-20mm?tris-hcl，ph=8-8.5；50-100mm?kcl；3-5mm?mgcl2。

33、更優(yōu)選地，所述引物混合液包含以下引物組中的至少一組：

34、(1)正向引物seq?id?no.34：tgaaggtgatgatttgcggg，

35、反向引物seq?id?no.35：catcctccataaaacagccca；

36、(2)正向引物seq?id?no.36：ctgtttgaagggcagtggac，

37、反向引物seq?id?no.37：caggtgtaataactgcccgc；

38、(3)正向引物seq?id?no.38：cgtgaggccgaaattatgca，

39、反向引物seq?id?no.39：cggccgccacgataataaaa；

40、(4)正向引物seq?id?no.40：gaggccgaaattatgcagca，

41、反向引物seq?id?no.41：agacagacgcgattccagat。

42、更進一步優(yōu)選地，所述引物混合液包含以下引物組：

43、(1)正向引物seq?id?no.34：tgaaggtgatgatttgcggg，

44、反向引物seq?id?no.35：catcctccataaaacagccca。

45、更優(yōu)選地，所述引物混合液中正向引物和反向引物的濃度分別為8-12μm。

46、更進一步優(yōu)選地，所述引物混合液中正向引物和反向引物的濃度分別為10μm。

47、本發(fā)明的第六方面提供了一種以上所述的摩氏摩根氏菌分型分子標志物或以上所述的摩氏摩根氏菌的分型方法或以上所述的引物或以上所述的用于檢測摩氏摩根氏菌的產(chǎn)品在構建摩氏摩根氏菌數(shù)據(jù)庫中的應用。

48、本發(fā)明的有益效果至少包括：

49、（1）現(xiàn)有的分型方法包括多位點序列分型，目前尚未建立摩氏摩根氏菌的mlst體系；對于脈沖場凝膠電泳法而言，實驗復雜周期長，對實驗人員要求高，成本較高，重復性差，分辨率低；對于血清學分析法而言，操作難度高，不易觀察結果；對于分子血清學分析法而言，存在部分不攜帶wzx和wzy基因的摩氏摩根氏菌，故此種方法不具有普遍性；全基因組測序分析一般作為分型的金標準，具有準確，精度高等優(yōu)點，但存在操作繁瑣，成本較高，周期長，對實驗人員要求也較高，在臨床不易開展等缺點。

50、本發(fā)明的分型方法簡單，快捷，易操作，檢測準確，對實驗人員要求較低，成本較低，便于不同實驗室之間進行比較，對于摩氏摩根氏菌分型的分辨率高，而且本發(fā)明的分型方法相比于全基因組測序分析具有同樣相似的準確性和特異性，大大節(jié)約成本，節(jié)省檢測時間，提高檢測效率，不僅利于臨床開展，也有利于對環(huán)境或動物菌株進行分析，對于摩氏摩根氏菌的院感監(jiān)測以及對分子溯源和系統(tǒng)進化分析都具有很高的優(yōu)勢。

51、（2）本發(fā)明中以摩氏摩根氏菌的 bladha基因為依據(jù)，設計出針對摩氏摩根氏菌的特異性引物，特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、重復性好，使用本發(fā)明的特異性引物進行pcr分析，從而實現(xiàn)對摩氏摩根氏菌快速準確地定性檢測。

52、（3）本發(fā)明公開的用于檢測以上所述摩氏摩根氏菌的試劑盒，具有檢測效率高，特異性好和準確性高等優(yōu)點。

53、（4）本發(fā)明公開的摩氏摩根氏菌的分型分子標志物，摩氏摩根氏菌的分型方法，引物或用于檢測摩氏摩根氏菌的產(chǎn)品都具有非常重要的實際應用價值。

54、本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

55、生物保藏

56、本發(fā)明涉及的摩氏摩根氏菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為：cgmcc?no:29646，保藏時間為：2024年1月17日。