本發(fā)明屬于病毒檢測，具體涉及一種甲型流感/乙型流感核酸檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、流感病毒屬正粘病毒科(orthomyxoviridae)，病毒顆粒呈球狀，直徑為80nm-120nm，為單股負鏈rna病毒，基因組約為13.6kb，由大小不等的8個獨立片段組成。病毒結(jié)構(gòu)自外而內(nèi)可分為包膜、基質(zhì)蛋白和核心三部分，核心包含病毒遺傳物質(zhì)單股負鏈rna，具有特異性。包膜上有3種膜蛋白——血凝素、神經(jīng)氨酸酶和m2蛋白(丙型流感病毒沒有m2蛋白)。血凝素能凝集多種動物紅細胞，是決定病毒有無感染性的首要條件；神經(jīng)氨酸酶能幫助病毒穿過呼吸道黏蛋白，并與上皮細胞結(jié)合，還能幫助子代病毒脫離感染細胞，有利于病毒的釋放。

2、流感病毒按照核蛋白和基質(zhì)蛋白的不同可分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒對人類致病性較低；丙型流感病毒只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染，很少造成流行。

3、甲型流感病毒為常見流感病毒，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，甲型流感病毒的亞型則被人們稱為“禽流感”，禽流是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，病毒基因變異后能夠感染人類，感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，人員和車輛往來是傳播本病的重要因素。

4、甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的；乙型和丙型流感僅在人之間傳播，以局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。

5、流感病毒主要傳播途徑是帶有流感病毒的飛沫，經(jīng)呼吸道進入體內(nèi)。病毒傳入人群后，傳染性強并可迅速蔓延，傳播速度和廣度與人口密度有關(guān)。流感病毒感染導(dǎo)致宿主細胞變性、壞死乃至脫落，造成黏膜充血、水腫和分泌物增加，從而產(chǎn)生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染癥狀，當(dāng)病毒蔓延至下呼吸道，則可能引起毛細支氣管炎和間質(zhì)性肺炎。因此，做到甲型和乙型流感病毒的早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療十分關(guān)鍵。

6、流感病毒的檢測方法主要有病毒的分離培養(yǎng)，免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。病毒的分離培養(yǎng)和免疫學(xué)診斷是流感的實驗室診斷的常規(guī)方法，分子生物學(xué)診斷中出現(xiàn)了許多快速特異的方法，三種方法具有以下特點：

7、1)病毒分離培養(yǎng)對技術(shù)要求較高，費用較昂貴，耗時長，且各實驗室分離陽性率各不相同，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要，目前僅用于實驗研究。

8、2)血清學(xué)方法不能高通量處理樣本，不能準確反映當(dāng)前是否感染或攜帶病毒。血清學(xué)的診斷還存在滯后性，該方法費時、費力，無法滿足快速、早期診斷的要求。

9、3)病毒核酸檢測：由于以上兩種方法費時、費力，為了提高檢測速度，可直接從臨床標本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物)中檢測病毒的核酸。該方法具有快速性、準確性和高靈敏性等優(yōu)點，能夠?qū)α鞲胁《靖腥咀鞒鲈缙谠\斷，給疫情的快速分析和控制提供有力的技術(shù)支撐。其中的實時定量rt-pcr檢測平臺已成為最簡捷和可靠的流感病毒檢測方法。

10、逆轉(zhuǎn)錄pcr/實時定量pcr的敏感度和特異度較高，是流感病毒、禽流感病毒等呼吸道病毒感染快速診斷的首選方法。盡管分子檢測方法(如pcr)在診斷中表現(xiàn)出色，但在某些情況下，可能會出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。特別是在病程早期或病毒載量較少的情況下，敏感性可能會受到限制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種甲型流感/乙型流感核酸檢測試劑盒，以解決背景技術(shù)中的問題。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種甲型流感/乙型流感核酸檢測試劑盒，試劑盒中包括：

4、(1)2×rt-pcr緩沖液；

5、(2)rt-pcr反應(yīng)酶系；

6、(3)引物探針反應(yīng)液；

7、(4)陰性對照；

8、(5)陽性對照。

9、進一步地，2×rt-pcr緩沖液中含有dntp(脫氧核糖核苷三磷酸)、鎂離子、pcr緩沖液，dntp的濃度為5mm，鎂離子的濃度為0.3mm。

10、進一步地，rt-pcr反應(yīng)酶系中含有udg酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶，dna聚合酶的添加量為2u，逆轉(zhuǎn)錄酶的添加量為20u，udg酶的添加量為0.1u。

11、進一步地，引物探針反應(yīng)液中含有甲型流感引物、甲型流感探針、乙型流感引物、乙型流感探針、內(nèi)參rnasep引物、rnasep探針，其序列如seq?id?no：1-9所示。

12、進一步地，陰性對照為depc水。

13、進一步地，陽性對照中含有甲型流感病毒保守區(qū)域、乙型流感病毒保守區(qū)域、內(nèi)參rnasep基因特異性片段的克隆質(zhì)粒，序列如seq?id?no：10所示。

14、本發(fā)明進一步提供了利用上述試劑盒同時檢測甲型流感和乙型流感核酸的檢測方法，包括以下步驟：

15、(1)樣品制備

16、提取待檢測的rna樣本，提取的rna樣本可立即用于檢測，若提取后不立即檢測，也可存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

17、(3)反應(yīng)體系配置

18、反應(yīng)液的配制：

19、將2×rt-pcr緩沖液、引物探針反應(yīng)液、rt-pcr反應(yīng)酶系置于冰上或者4℃條件下，融化后搖均，然后按照12.5μl∶1μl∶6.5μl的比例取2×rt-pcr緩沖液、rt-pcr反應(yīng)酶系和引物探針反應(yīng)液，加入離心管中，充分混勻、離心，得到pcr反應(yīng)液，若待檢樣品數(shù)為n(包含陽性、陰性對照)，則按n+1個反應(yīng)配制反應(yīng)體系，防止加樣損失導(dǎo)致反應(yīng)體系不足，如下表所示；

20、 組分 1個反應(yīng)添加量 (n+1)個反應(yīng)體系添加量 2×rt-pcr反應(yīng)液 12.5μl 12.5μl×(n+1) rt-pcr反應(yīng)酶系 1μl 1μl×(n+1) 引物探針反應(yīng)液 6.5μl 6.5μl×(n+1)

21、體系分裝：

22、將配制好的pcr反應(yīng)液進行分裝，按照20μl的添加量分裝于熒光pcr儀適用的pcr管中；

23、樣品檢測：

24、在裝有pcr反應(yīng)液的pcr管中分別加入步驟(1)提取后的待測樣rna樣本、陰性對照、陽性對照各5μl，終體積為25μl，蓋緊管蓋，得到反應(yīng)管。

25、(3)上機檢測

26、將步驟(2)獲得的反應(yīng)管放入熒光pcr檢測儀中，按照以下程序上機檢測，程序參數(shù)設(shè)定如下表所示：

27、

28、注：60℃時熒光檢測，檢測通道為fam、vic、cy5。

29、(4)結(jié)果分析

30、反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動保存結(jié)果，陰性對照無曲線擴增，且陽性對照fam、vic、cy5三個通道均有曲線擴增(ct≤30)，實驗成立，否則視為結(jié)果無效；

31、若樣品有s型擴增且ct值≤35則判定該通道反應(yīng)陽性(+)；

32、若ct值>38或未檢出則判定該通道反應(yīng)陰性(-)；

33、若有s型擴增且35＜ct值≤38則為不確定樣品，需重新提取核酸后再次檢測。

34、具體結(jié)果的判定方法如下表所示：

35、

36、本發(fā)明的有益效果：

37、本發(fā)明提供的試劑盒適用于定性檢測鼻咽拭子和痰樣本中甲型/乙型流感病毒rna，基于實時熒光pcr技術(shù)，通過對pcr擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定性的分析，分別選取人感染甲型流感病毒的m基因和感染乙型流感病毒的np基因的保守區(qū)作為擴增靶區(qū)域，人類rnasep管家基因作為內(nèi)參靶序列，設(shè)計特異性引物和探針，通過一步法實時熒光pcr體系擴增，對人感染甲型/乙型流感病毒進行定性檢測，敏感度高，對甲型流感病毒最低檢測限ct值為32.6，滴度約為0.6×10-4tcid50，對乙型流感病毒最低檢測限ct值為35.6，滴度約為0.7×10-5tcid50，且在檢測體系中加入了人源基因的檢測作為內(nèi)參，能夠提示采樣及核酸提取過程是否正常，避免因采樣不合格或者核酸提取操作失誤而引入的假陰性結(jié)果，能夠做到不漏檢、不多檢，同時，通過調(diào)整體系各組分和比例，實現(xiàn)快速檢測的目的。