本發(fā)明屬于生物，涉及一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白及其疫苗。

背景技術(shù)：

1、egfr在許多人類上皮性腫瘤中過(guò)表達(dá)，如頭頸癌和肺癌等，其基因異常擴(kuò)增或突變導(dǎo)致的egfr過(guò)表達(dá)與腫瘤疾病進(jìn)展、治療反應(yīng)差、預(yù)后不良和生存率差有關(guān)。由于egfr在癌癥發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的重要作用，因此被認(rèn)為是腫瘤的一種標(biāo)志性抗原，可將其作為腫瘤治療的一個(gè)很好的靶點(diǎn)。目前，已經(jīng)開發(fā)出了幾種抗egfr相關(guān)的被動(dòng)免疫療法藥物，其中臨床批準(zhǔn)的治療藥物包括小分子抑制劑如酪氨酸激酶抑制劑，以及單克隆抗體如治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌和頭頸癌的西妥昔單抗和治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的帕尼單抗。然而，小分子抑制劑的生物相容性、藥代動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性等限制了其臨床應(yīng)用，單克隆抗體因成本高、輸液反應(yīng)、需反復(fù)給藥和耐藥的出現(xiàn)等同樣限制了其臨床應(yīng)用。因此，需要尋找更安全、更低成本和更有效的治療方法。接種疫苗刺激抗腫瘤免疫具有易于給藥和誘導(dǎo)持久的腫瘤特異性免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。免疫系統(tǒng)具有識(shí)別和摧毀異常細(xì)胞的天然能力，其中包括癌變細(xì)胞。接種疫苗通過(guò)主動(dòng)免疫治療egfr陽(yáng)性腫瘤是一種行之有效的策略，但目前還沒(méi)有獲批上市相關(guān)的人用疫苗，因此egfr疫苗的研制勢(shì)在必行。主動(dòng)免疫治療egfr陽(yáng)性腫瘤的一種有效途徑是打破對(duì)自身egfr的免疫耐受，誘導(dǎo)對(duì)受體陽(yáng)性腫瘤的自身免疫。

2、免疫信息學(xué)是尋找針對(duì)不同抗原的潛在候選疫苗的最佳途徑之一，使用計(jì)算機(jī)等方法識(shí)別和預(yù)測(cè)抗原區(qū)域不僅降低了實(shí)驗(yàn)成本，還節(jié)省了時(shí)間和精力，從而有助于設(shè)計(jì)更好和廣泛的治療方法。人和小鼠的egfr高度同源，在接種疫苗之前，動(dòng)物體內(nèi)不存在針對(duì)egfr的內(nèi)源性免疫反應(yīng)。此外，腫瘤在小鼠體內(nèi)快速生長(zhǎng)的能力表明，對(duì)腫瘤抗原的任何內(nèi)源性免疫反應(yīng)都是最小的。同時(shí)，為疫苗選擇高度同源的靶序列，以確保對(duì)疫苗的反應(yīng)具備交叉性而不僅僅是異種性質(zhì)。egfr作為自身抗原，其免疫自耐受而引起的固有低免疫反應(yīng)，需要強(qiáng)大的免疫刺激佐劑才能有效地激活天然免疫和獲得性免疫，從而顯示出對(duì)多種癌癥類型的治療效果。

3、因此，亟需開發(fā)一種新的有效的針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的的疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決所述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白及其疫苗，該方法適用于制備針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體egfr過(guò)表達(dá)的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白疫苗，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白，所述重組蛋白從5’端到3’端依次由his標(biāo)簽、dtt、gslinker、eg、gslinker、eg串聯(lián)組成，其中，dtt的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，gslinker的氨基酸序列如seq?idno.2所示，所述eg選自eg3、eg5、eg6和eg7中的一種，所述eg3、eg5、eg6和eg7的氨基酸序列分別如seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5、seq?id?no.6所示。

4、上述技術(shù)方案中，針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白包括：dtt-gs-eg3-gs-eg3(簡(jiǎn)稱dtt-eg3)、dtt-gs-eg5-gs-eg5(簡(jiǎn)稱dtt-eg5)、dtt-gs-eg6-gs-eg6(簡(jiǎn)稱dtt-eg6)、dtt-gs-eg7-gs-eg7(簡(jiǎn)稱dtt-eg7)。

5、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子表達(dá)所述的針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白。

6、上述技術(shù)方案中，dtt-eg3、dtt-eg5、dtt-eg6、dtt-eg7的核苷酸序列依次如seqid?no.7、seq?id?no.8、seq?id?no.9、seq?id?no.10所示。將所述核苷酸序列分別構(gòu)建在pet-28a(+)載體的ndeⅰ和bamhⅰ之間。

7、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體能夠表達(dá)所述的針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白，所述重組表達(dá)載體含有所述的核酸分子。

8、進(jìn)一步地，所述重組表達(dá)載體包括表達(dá)質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體中的一種。

9、進(jìn)一步地，所述表達(dá)質(zhì)粒載體為pet-28a(+)表達(dá)載體。

10、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種工程菌或者工程化細(xì)胞，所述工程菌或者工程化細(xì)胞包含任一所述的重組表達(dá)載體。

11、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白的制備方法，所述方法包括：

12、獲得針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白；

13、構(gòu)建并獲得所述針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白的表達(dá)質(zhì)粒；

14、將所述se的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行分泌表達(dá)和純化，獲得純化的重組針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白。

15、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白疫苗，所述針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白疫苗包含所述的重組蛋白以及藥學(xué)上接受的佐劑。

16、進(jìn)一步，所述佐劑包括氫氧化鋁、卵磷脂、弗氏佐劑、mpl?tm、il-12、氫氧化鋁聯(lián)合cpg?odn復(fù)合佐劑、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐劑中的至少一種。

17、在本發(fā)明的第七方面，提供了一種所述的針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白疫苗的制備方法，所述方法包括：

18、采用所述的方法獲得針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白；

19、將所述dtt-eg串聯(lián)重組蛋白與佐劑混勻制備得到。

20、進(jìn)一步地，所述dtt-eg串聯(lián)重組蛋白與佐劑混勻中，200μl的疫苗以pbs為溶劑包含50±5μg?dtt-eg重組蛋白、300±10μg鋁佐劑alum以及30±5μg?cpg寡核苷酸佐劑混勻制備得到。

21、更進(jìn)一步地，所述dtt-eg串聯(lián)重組蛋白與佐劑混勻中，200μl的疫苗以pbs為溶劑包含50μg?dtt-eg重組蛋白、300μg鋁佐劑alum以及30μg?cpg寡核苷酸佐劑混勻制備得到。

22、本發(fā)明實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

23、本發(fā)明提供的抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd結(jié)構(gòu)域的納米抗體；

24、1、本發(fā)明提供的針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白、重組表達(dá)載體、工程菌或者工程化細(xì)胞和亞單位疫苗，通過(guò)基于計(jì)算機(jī)算法的免疫信息學(xué)表位預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)并篩選人egfr-ecd抗原表位肽段，以dtt為載體蛋白構(gòu)建串聯(lián)重組蛋白并進(jìn)行表達(dá)純化。以alum和cpg為佐劑構(gòu)建疫苗免疫小鼠，研究重組蛋白疫苗引發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。測(cè)定重組蛋白疫苗針對(duì)egfr的抗體滴度，在體外培養(yǎng)條件下以相應(yīng)蛋白再次刺激對(duì)應(yīng)疫苗免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖、對(duì)a549細(xì)胞的殺傷和ifn-γ的釋放，測(cè)定免疫小鼠外周血淋巴細(xì)胞cd4和cd8的表達(dá)情況。同時(shí)構(gòu)建預(yù)防性和治療性a549小鼠腫瘤模型，檢測(cè)了dtt-eg疫苗對(duì)腫瘤的治療效果，并通過(guò)對(duì)腫瘤組織切片h&e染色和免疫組化分析cd8+t細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。綜合研究重組蛋白dtt-eg疫苗的免疫原性和抗腫瘤效果。

25、2、本發(fā)明在充分借鑒腫瘤治療研究成果基礎(chǔ)上，通過(guò)開展蛋白表達(dá)與純化步驟，建立了一種針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性腫瘤的dtt-eg串聯(lián)重組蛋白疫苗的制備方法制備方法，

26、3、本發(fā)明方法的dtt-eg疫苗在預(yù)防性(圖8)和治療性(圖9)小鼠腫瘤模型顯示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，用于制備dtt-eg串聯(lián)重組蛋白疫苗，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。