本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫治療，具體涉及靶向claudin?18.2嵌合抗原和嵌合轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)受體、其修飾的免疫細(xì)胞及其用途。

背景技術(shù)：

1、緊密蛋白(claudin，cldn)是正常組織緊密連接中重要的一種蛋白質(zhì)，具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其功能是參與細(xì)胞旁通透性和電導(dǎo)等過(guò)程的調(diào)節(jié)。claudin家族包含至少27個(gè)成員，其中claudin?18.2(cldn18.2)是claudin蛋白家族中的一員，它是一種具有高度組織表達(dá)特異性的跨膜蛋白，在正常組織中表達(dá)水平非常低，但在非惡性胃粘膜中高度選擇性表達(dá)，與在鄰近細(xì)胞表面表達(dá)的claudin?18.2-分子結(jié)合構(gòu)成緊密連接復(fù)合體，形成選擇性可滲透屏障，實(shí)現(xiàn)組織特異性滲透。這種緊密連接蛋白在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中會(huì)暴露在腫瘤細(xì)胞表面上，使其成為靶向癌癥治療的一個(gè)可接觸的靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，在正常生理狀態(tài)下，claudin?18.2僅在胃粘膜上已分化的上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在其它的健康組織中均無(wú)表達(dá)。但在胃腸道腫瘤如胃癌、結(jié)直腸腺癌、食管癌、胰腺癌，以及肺癌、肺腺癌、肝癌、卵巢癌、腎癌等多種腫瘤中，claudin18.2卻呈現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞極性的紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞表面claudin?18.2蛋白表位暴露，并出現(xiàn)異常激活。這一正常組織局限性表達(dá)而腫瘤中特異性高表達(dá)的特點(diǎn)使得claudin?18.2成為了理想的實(shí)體瘤治療靶點(diǎn)。

2、現(xiàn)有的car-t細(xì)胞療法在cldn18.2表達(dá)陽(yáng)性的晚期胃腸道腫瘤臨床試驗(yàn)中顯示出治療潛力，整體耐受性良好和安全可控。但是car-t療法在胃腸道腫瘤等實(shí)體瘤中仍舊面臨諸多挑戰(zhàn)。腫瘤微環(huán)境中低ph、低氧、高滲透等環(huán)境會(huì)有免疫抑制效果，不利于car-t細(xì)胞的存活和抗腫瘤作用。同時(shí)腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制細(xì)胞，分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tgf-β)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和抑制細(xì)胞毒性t細(xì)胞。另一方面，t細(xì)胞的免疫活性存在內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制，活化的t細(xì)胞會(huì)上調(diào)表達(dá)多種免疫抑制分子例如pd-1，使t細(xì)胞進(jìn)入耗竭狀態(tài)而凋亡。

3、claudin?18.2作為治療實(shí)體瘤的一個(gè)重要靶點(diǎn)，針對(duì)其car-t細(xì)胞的研究尚處于起步階段，國(guó)內(nèi)也尚未有該靶點(diǎn)的藥物上市。鑒于此，不斷改進(jìn)和完善car的結(jié)構(gòu)，創(chuàng)新和開(kāi)發(fā)新的car-t細(xì)胞及其療法、改變免疫被抑制的微環(huán)境、提高car-t細(xì)胞的特異性和抗腫瘤活性，不僅可以更精準(zhǔn)地定位腫瘤靶點(diǎn)，而且能更高效地殺傷腫瘤，對(duì)于提高臨床療效具有重要的意義和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種靶向claudin?18.2的嵌合抗原受體、含有該嵌合抗原受體的免疫效應(yīng)細(xì)胞，及其應(yīng)用。所要解決的技術(shù)問(wèn)題不限于所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括第一單域抗體和第二單域抗體，所述第一單域抗體包含氨基酸序列分別是seq?id?no.1的第47-54位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr1、seq?id?no.1的第72-78位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr2和seq?id?no.1的第116-130位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr3；

3、所述第二單域抗體包含氨基酸序列分別是seq?id?no.1的第182-188位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr1、seq?idno.1的第206-215位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr2和seq?id?no.1的第254-267位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr3。

4、所述嵌合抗原受體、所述第一單域抗體和所述第二單域抗體均靶向claudin18.2。

5、所述第一單域抗體的名稱可為claudin?18.2-vhh#223。所述第二單域抗體的名稱可為claudin18.2-vhh#357。

6、所述互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的序列根據(jù)kabat編號(hào)系統(tǒng)定義。

7、所述單域抗體只有重鏈抗體的可變區(qū)(vhh)，依次由框架區(qū)fr1、互補(bǔ)決定區(qū)cdr1、框架區(qū)fr2、互補(bǔ)決定區(qū)cdr2、框架區(qū)fr3、互補(bǔ)決定區(qū)cdr3和框架區(qū)fr4組成。

8、上述嵌合抗原受體中，所述第一單域抗體可為下述任一種：

9、a1)氨基酸序列如seq?id?no.1的第22-141位所示的蛋白質(zhì)；

10、a2)將seq?id?no.1的第22-141位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的置換、缺失和/或添加得到的與a1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

11、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端連接標(biāo)簽或信號(hào)肽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)；

12、所述第二單域抗體可為下述任一種：

13、b1)氨基酸序列如seq?id?no.1的第157-278位所示的蛋白質(zhì)；

14、b2)將seq?id?no.1的第157-278位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的置換、缺失和/或添加得到的與b1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

15、b3)在b1)或b2)的n端和/或c端連接標(biāo)簽或信號(hào)肽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

16、進(jìn)一步地，氨基酸序列的不一致處可在框架區(qū)(fr)，例如在框架區(qū)中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸置換、缺失或添加。

17、所述框架區(qū)(framework?region，fr)為本領(lǐng)域已知的，是指可變區(qū)(vhh)中除了cdr以外的區(qū)域，包括fr1、fr2、fr3和fr4。

18、所述幾個(gè)可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)。

19、進(jìn)一步地，所述第二單域抗體可位于所述第一單域抗體的n端或c端。具體地，所述第二單域抗體位于所述第一單域抗體的c端。

20、進(jìn)一步地，所述第一單域抗體和所述第二單域抗體可通過(guò)接頭(linker)連接。

21、所述接頭(linker)可為柔性肽接頭，例如包括甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸和/或賴氨酸殘基的肽接頭。所述肽接頭可由1-40個(gè)氨基酸組成。

22、進(jìn)一步地，所述接頭(linker)包括但不限于：(g)n、(s)n、(gxs)n、(sxg)n、(gssgg)n(seq?id?no.11)、(ggsgg)n(seq?id?no.12)、(gsggsg)n(seq?id?no.13)、(gsgsgs)n(seqid?no.14)、(ggqgg)n(seq?id?no.15)、(eaaak)n(seq?id?no.16)和iegrmd(seq?idno.17)，以及它們的各種組合。其中：n可以是1-10之間的任何整數(shù)；x可以是1-6之間的任何整數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭為(ggggs)3(seq?id?no.18)。

23、所述第一單域抗體(包括其抗原結(jié)合片段)和所述第二單域抗體(包括其抗原結(jié)合片段)可通過(guò)接頭連接成靶向claudin?18.2兩個(gè)不同表位的雙表位單域抗體。所述雙表位單域抗體構(gòu)成本發(fā)明所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

24、進(jìn)一步地，所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域從n端到c端依次可為所述第一單域抗體、所述接頭、所述第二單域抗體。所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可如seq?idno.1的第22-278位所示。

25、上述嵌合抗原受體中，所述胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域包括共刺激結(jié)構(gòu)域、激活結(jié)構(gòu)域、干擾素和嵌合轉(zhuǎn)換受體，所述嵌合轉(zhuǎn)換受體包括pd-1的胞外區(qū)、tgfβ受體ii型的胞外區(qū)，以及cd27的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。

26、所述嵌合轉(zhuǎn)換受體名稱可為pd-1&trii&cd27，可用于將pd-1和tgfβ傳導(dǎo)的免疫抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)換為cd27介導(dǎo)的t細(xì)胞活化信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效和持久性殺傷，提高car細(xì)胞抵御免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的能力。

27、進(jìn)一步地，所述嵌合轉(zhuǎn)換受體可位于所述嵌合抗原受體的c末端。

28、進(jìn)一步地，所述嵌合轉(zhuǎn)換受體從n端到c端依次可為pd-1的胞外區(qū)、tgfβ受體ii型的胞外區(qū)、cd27的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。

29、進(jìn)一步地，所述嵌合轉(zhuǎn)換受體的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第739-1144位所示。

30、所述干擾素可為i型干擾素(如ifnα(ifn-α)、ifnβ(ifn-β)或ifnω(ifn-ω))。

31、進(jìn)一步地，所述干擾素可為ifnα。

32、進(jìn)一步地，所述ifnα的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第529-716位所示。

33、所述胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域可包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域。所述共刺激結(jié)構(gòu)域可包含共刺激分子的整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部分，或其功能片段?！肮泊碳し肿印笨芍冈趖細(xì)胞上與共刺激配體特異性結(jié)合，由此介導(dǎo)t細(xì)胞的共刺激反應(yīng)(例如增殖)的同源結(jié)合配偶體。

34、所述共刺激結(jié)構(gòu)域可以是來(lái)自共刺激分子的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，例如所述共刺激結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、icam-1(cd54)、lfa-1(cd11a)、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、2b4、cd150(slamf1)、cd270(hvem)、cd278(icos)或dap10的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

35、所述激活結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

36、上述嵌合抗原受體中，所述共刺激結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于4-1bb，和/或，所述激活結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于cd3ζ。

37、進(jìn)一步地，所述共刺激結(jié)構(gòu)域可為4-1bb的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

38、進(jìn)一步地，所述共刺激結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第348-394位所示。

39、進(jìn)一步地，所述激活結(jié)構(gòu)域可為cd3ζ的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

40、進(jìn)一步地，所述激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第395-506位所示。

41、所述胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域還可包括接頭，用于連接所述cd3ζ、ifnα和嵌合轉(zhuǎn)換受體。

42、進(jìn)一步地，所述接頭可為可裂解連接子。

43、進(jìn)一步地，所述可裂解連接子包括p2a、f2a、t2a和e2a，或它們的任何組合，但不限于此。所述p2a的氨基酸序列可如seq?id?no.7所示。所述f2a的氨基酸序列可如seq?idno.8所示。所述t2a的氨基酸序列可如seq?id?no.9所示。所述e2a的氨基酸序列可如seq?idno.10所示。

44、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述可裂解連接子為p2a。

45、雖然本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)建的嵌合抗原受體中采用了p2a作為連接接頭，但本發(fā)明不限于該特定接頭，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明嵌合抗原受體中的p2a進(jìn)行替換，例如可采用與p2a具有相同“自我剪切”功能的f2a、t2a和e2a等。只要構(gòu)建的嵌合抗原受體與本發(fā)明的嵌合抗原受體功能相同，均視為與本發(fā)明嵌合抗原受體等同的嵌合抗原受體。

46、所述胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域從n端到c端依次可為共刺激結(jié)構(gòu)域4-1bb、激活結(jié)構(gòu)域cd3ζ、p2a、ifnα、p2a、嵌合轉(zhuǎn)換受體pd-1&trii&cd27。

47、進(jìn)一步地，所述胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第348-1144位所示。

48、本文所述嵌合抗原受體中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、cd3ζ、cd8a(cd8α)、cd4、cd9、cd45、cd16、cd19、cd22、cd28、cd28t、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152或cd154的跨膜結(jié)構(gòu)域。

49、進(jìn)一步地，所述跨膜結(jié)構(gòu)域位于所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域之間，負(fù)責(zé)維持car分子在t細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。

50、進(jìn)一步地，所述跨膜結(jié)構(gòu)域可為cd8a跨膜區(qū)(tm)。

51、本文所述嵌合抗原受體還可包括位于所述跨膜結(jié)構(gòu)域n端的鉸鏈結(jié)構(gòu)域(hinge)。

52、進(jìn)一步地，所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于cd8a(cd8α)、cd4、cd5、cd7、cd28、cd134、cd137、icos、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igd、ige或igm的鉸鏈區(qū)。

53、進(jìn)一步地，所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域可為cd8a鉸鏈區(qū)(hinge)。

54、進(jìn)一步地，所述cd8a鉸鏈區(qū)(hinge)和跨膜區(qū)(tm)的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第279-347位所示。

55、本文所述嵌合抗原受體還可包括位于所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域n端的信號(hào)肽(signal)。

56、進(jìn)一步地，所述信號(hào)肽可來(lái)源于cd4、cd8、cd8a、cd28、cd137和gm-csf的信號(hào)肽。

57、進(jìn)一步地，所述信號(hào)肽可為人源cd8信號(hào)肽。所述人源cd8信號(hào)肽的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第1-21位所示。

58、本文所述嵌合抗原受體自n-端至c-端依次可為信號(hào)肽(signal)、第一單域抗體、接頭(linker)、第二單域抗體、cd8a鉸鏈區(qū)、cd8a跨膜區(qū)、共刺激結(jié)構(gòu)域4-1bb、激活結(jié)構(gòu)域cd3ζ、可裂解連接子p2a、ifnα、可裂解連接子p2a、嵌合轉(zhuǎn)換受體pd-1&trii&cd27。

59、進(jìn)一步地，本文所述嵌合抗原受體可為下述任一種：

60、c1)氨基酸序列如seq?id?no.1的第22-1144位所示的蛋白質(zhì)；

61、c2)將seq?id?no.1的第22-1144位所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的置換、缺失和/或添加得到的與c1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

62、c3)在c1)或c2)的n端和/或c端連接標(biāo)簽或信號(hào)肽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

63、進(jìn)一步地，c3)中所述融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列可如seq?id?no.1所示。

64、氨基酸序列是seq?id?no.1的第22-1144位的蛋白質(zhì)為不含有信號(hào)肽的嵌合抗原受體，含有信號(hào)肽的嵌合抗原受體的氨基酸序列可如seq?id?no.1所示。

65、本文所述置換可為保守置換。

66、a3)、b3)、c3)中所述連接可通過(guò)肽鍵(peptide?bond)直接連接，或通過(guò)接頭連接。

67、為了使本文所述嵌合抗原受體便于分離、純化、檢測(cè)和/或定位，可在所述嵌合抗原受體的氨基末端或羧基末端連接標(biāo)簽蛋白。所述標(biāo)簽包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白、trx(硫氧還蛋白)標(biāo)簽蛋白、氮利用底物a(nusa)標(biāo)簽蛋白、his標(biāo)簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha(流感血凝素)標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、lacz標(biāo)簽蛋白、cbd(纖維素結(jié)合域)標(biāo)簽蛋白、噬菌體t7蛋白激酶(t7pk)標(biāo)簽蛋白、gfp(綠色熒光蛋白)、cfp(青色熒光蛋白)、yfp(黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標(biāo)簽蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何根據(jù)期望目的選擇合適的標(biāo)簽蛋白。標(biāo)簽的使用不改變目的蛋白的功能，其目的在于分離、純化、檢測(cè)或示蹤，因此適用于本技術(shù)的標(biāo)簽蛋白并不局限于特定種類。標(biāo)簽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)裂解法或酶法(如引入蛋白酶切位點(diǎn)利用tev蛋白酶切割去除標(biāo)簽)與目的蛋白進(jìn)行分離。

68、本發(fā)明還提供了生物材料，所述生物材料可為下述任一種：

69、d1)編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子；

70、d2)含有d1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

71、d3)含有d1)所述核酸分子的重組載體；

72、d4)含有d1)所述核酸分子的重組微生物；

73、d5)含有d1)所述核酸分子的重組宿主細(xì)胞。

74、所述生物材料均可表達(dá)本文中任一所述嵌合抗原受體。

75、所述重組載體可為將編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子(如seq?idno.2所示的dna分子)克隆到骨架載體中得到的重組載體。雖然本發(fā)明提供的實(shí)施例利用的骨架載體是puc57載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但本發(fā)明可不限于該特定載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用其它合適的載體，例如慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、非病毒載體轉(zhuǎn)位子系統(tǒng)、crispr-cas系統(tǒng)，或其他用于克隆或表達(dá)的骨架載體等。只要該載體能夠克隆或表達(dá)編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子即可。

76、進(jìn)一步地，所述重組載體具體可為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體mp71-claudin?18.2car-ic。所述mp71-claudin18.2car-ic是將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體mp71的noti和ecori識(shí)別位點(diǎn)間的片段(小片段)替換為核苷酸序列是序列表中seq?id?no.2的dna片段，保持逆轉(zhuǎn)錄病毒載體mp71的其他核苷酸序列不變，得到的重組表達(dá)載體。

77、上述生物材料中，所述核酸分子可為下述任一種：

78、e1)編碼序列或核苷酸序列如seq?id?no.2的第64-3432位或seq?id?no.2所示的dna分子；

79、e2)與seq?id?no.2的第64-3432位限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且編碼氨基酸序列如seq?id?no.1的第22-1144位所示的嵌合抗原受體的dna分子；

80、e3)與seq?id?no.2限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的嵌合抗原受體的dna分子。

81、seq?id?no.2所示的dna分子編碼氨基酸序列為seq?id?no.1的嵌合抗原受體(包含信號(hào)肽)。

82、seq?id?no.2的第64-3432位所示的dna分子編碼氨基酸序列為seq?id?no.1的第22-1144位所示的嵌合抗原受體(不包含信號(hào)肽)。

83、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定點(diǎn)突變(包括寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、pcr介導(dǎo)的定點(diǎn)突變和盒式突變等)或定向進(jìn)化(包括易錯(cuò)pcr、dna改組和體外隨機(jī)引發(fā)重組等)的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工改造的、與本發(fā)明編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核苷酸序列(如seq?id?no.2)具有75％以上同一性的核苷酸序列，只要編碼本文中任一所述嵌合抗原受體且具有與本文中任一所述嵌合抗原受體相同的功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

84、本文所述核酸分子還可包括在seq?id?no.2所示核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)密碼子偏好性改造得到的核酸分子?？紤]到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

85、與本文任一所述嵌合抗原受體的序列具有改善的親和力的變體可通過(guò)采用在本領(lǐng)域已知的方法來(lái)獲得，并包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。例如，氨基酸置換可用于獲得具有進(jìn)一步改善的親合力的嵌合抗原受體?；蛘?，核苷酸序列的密碼子優(yōu)化也可用來(lái)改善用于產(chǎn)生嵌合抗原受體的表達(dá)系統(tǒng)中的翻譯效率。

86、在某些實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明任一所述嵌合抗原受體中的單域抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)或框架區(qū)內(nèi)發(fā)生置換、插入或刪除，只要此類變化不實(shí)質(zhì)性降低嵌合抗原受體結(jié)合抗原的能力。例如，可以對(duì)互補(bǔ)決定區(qū)和/或框架區(qū)做出保守變化(例如，保守替代，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，氨基酸的保守性取代不改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能)，其不實(shí)質(zhì)性降低結(jié)合親和力。例如，此類變化可以在互補(bǔ)決定區(qū)中的抗原接觸殘基以外。

87、本發(fā)明還提供了修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞包含本文中任一所述的嵌合抗原受體或所述核酸分子。

88、所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可為本文中任一所述嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞(即car修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，car細(xì)胞)，其表達(dá)本文中任一所述的嵌合抗原受體。

89、進(jìn)一步地，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可包括t細(xì)胞、nk細(xì)胞、b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)、外周血單核細(xì)胞(pbmc)和單核細(xì)胞(mc)。

90、所述免疫效應(yīng)細(xì)胞還可包括(或來(lái)源于)能夠在體內(nèi)或體外被誘導(dǎo)分化為免疫效應(yīng)細(xì)胞的干細(xì)胞，例如成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)、全能干細(xì)胞或造血干細(xì)胞(hsc)。

91、所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是自體的，也可以是非自體的(同種異體的、同基因的或異種的)。進(jìn)一步地，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞是自體的或同種異體的。

92、進(jìn)一步地，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可包括car-t細(xì)胞、car-nk細(xì)胞、car-nkt細(xì)胞、car-γδt細(xì)胞、car-αβt細(xì)胞、car-調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(car-treg細(xì)胞)、car-mait細(xì)胞、car-b細(xì)胞、car-巨噬細(xì)胞(car-m細(xì)胞)、car-樹(shù)突狀細(xì)胞(car-dc細(xì)胞)、car-外周血單核細(xì)胞(car-pbmc細(xì)胞)、car-單核細(xì)胞(car-mc細(xì)胞)、car-ipsc細(xì)胞和car-psc細(xì)胞但不限于此。

93、進(jìn)一步地，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可為t細(xì)胞。

94、所述t細(xì)胞可包括cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)、初始t細(xì)胞、效應(yīng)t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞(包括干性記憶t細(xì)胞、中央記憶t細(xì)胞和效應(yīng)記憶t細(xì)胞)、αβt細(xì)胞、γδt細(xì)胞、自然殺傷性t細(xì)胞(natural?killer?t?cell，nkt細(xì)胞)和黏膜相關(guān)恒定t細(xì)胞(mucosal-associated?invariant?t?cells，mait細(xì)胞)等但不限于此。

95、進(jìn)一步地，所述t細(xì)胞可來(lái)源于腫瘤患者或健康志愿者。

96、進(jìn)一步地，所述t細(xì)胞可來(lái)源于外周血、單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤但不限于此。

97、所述t細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(例如密度梯度分離技術(shù)、黏附分離法、磁珠分離技術(shù)、流式細(xì)胞分選技術(shù)等)分離獲得。

98、進(jìn)一步地，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可為car-t細(xì)胞。

99、進(jìn)一步地，所述car-t細(xì)胞可為claudin?18.2car-ic?t細(xì)胞。

100、所述claudin?18.2car-ic?t細(xì)胞是通過(guò)基因工程體外重組的方法將本發(fā)明構(gòu)建的嵌合抗原受體的基因轉(zhuǎn)入t細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)得到的car-t細(xì)胞。

101、進(jìn)一步地，所述claudin?18.2car-ic?t細(xì)胞含有和/或表達(dá)seq?id?no.2或seq?idno.2的第64-3432位所示的dna分子。

102、所述claudin?18.2car-ic?t細(xì)胞可具有下述至少任一種特性：

103、(1)分泌t細(xì)胞特異性效應(yīng)分子ifn-γ；

104、(2)特異性殺傷claudin?18.2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞；

105、(3)抑制claudin?18.2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞增殖；

106、(4)抑制claudin?18.2陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)；

107、(5)抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用和/或t細(xì)胞耗竭作用；

108、(6)將pd-1和tgfβ傳導(dǎo)的免疫抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)換為cd27介導(dǎo)的t細(xì)胞活化信號(hào)。

109、本發(fā)明還提供了本文中任一所述的嵌合抗原受體、所述生物材料或本文中任一所述的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞在制備具有如下任一種功能的產(chǎn)品中的用途：

110、f1)預(yù)防或治療腫瘤；

111、f2)預(yù)防或治療claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾?。?/p>

112、f3)殺傷claudin?18.2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞；

113、f4)抑制claudin?18.2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞增殖；

114、f5)抑制claudin?18.2陽(yáng)性的腫瘤生長(zhǎng)；

115、f6)抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用和/或t細(xì)胞耗竭作用；

116、f7)將pd-1和tgfβ傳導(dǎo)的免疫抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)換為cd27介導(dǎo)的t細(xì)胞活化信號(hào)。

117、本文所述腫瘤或claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病可為claudin18.2陽(yáng)性腫瘤。

118、進(jìn)一步地，所述claudin18.2陽(yáng)性腫瘤可為claudin18.2陽(yáng)性實(shí)體腫瘤。

119、進(jìn)一步地，所述claudin18.2陽(yáng)性實(shí)體腫瘤可為claudin18.2陽(yáng)性消化系統(tǒng)腫瘤。

120、進(jìn)一步地，所述claudin18.2陽(yáng)性腫瘤可為claudin18.2陽(yáng)性癌癥，也可為claudin18.2陽(yáng)性的間皮瘤。

121、進(jìn)一步地，所述癌癥可選自胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸腺癌、肺癌、肺腺癌、肝癌、腎癌、卵巢癌、支氣管癌、乳腺癌、膀胱癌、頭頸癌、膽囊癌、膽管癌和胃食管交界處(gej)腺癌。

122、進(jìn)一步地，所述癌癥包括早期癌癥、中期癌癥、中晚期癌癥、晚期癌癥、復(fù)發(fā)性癌癥、轉(zhuǎn)移性癌癥等。

123、本發(fā)明還提供了本文中任一所述的嵌合抗原受體或所述生物材料在制備修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞(如car-t細(xì)胞)中的用途。

124、本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括本文中任一所述的嵌合抗原受體、所述生物材料或本文中任一所述的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。

125、所述藥學(xué)上可接受的載體選自稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、吸收促進(jìn)劑、吸附載體、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、煙霧化劑、懸浮劑、增塑劑和分散劑。

126、所述藥物組合物的劑型可包括吸入制劑、口服制劑和注射制劑但不限于此。所述吸入制劑可為吸入氣霧劑、吸入粉霧劑、吸入噴霧劑、吸入液體制劑、吸入霧化劑、吸入用凍干粉針劑或鼻噴劑。所述口服制劑可為片劑、粉劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、固體飲料或口服液。所述注射制劑可為注射液或注射用粉針劑。

127、為了將所述藥物組合物制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑(載體)，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油等載體，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等載體。

128、所述藥物組合物還可包括細(xì)胞凍存液。所述細(xì)胞凍存液用于將細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，防止在凍融過(guò)程中形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害，其主要成分可包括：二甲基亞砜、氯化鈉、人血白蛋白、右旋糖酐葡萄糖、右旋糖和/或血漿電解質(zhì)-a等。

129、所述藥物組合物可具有下述至少一種用途：(1)用于預(yù)防或治療claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾??；(2)殺傷claudin?18.2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞；(3)抑制claudin?18.2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞增殖；(4)抑制claudin?18.2陽(yáng)性的腫瘤生長(zhǎng)；(5)抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用和/或t細(xì)胞耗竭作用；(6)將pd-1和tgfβ傳導(dǎo)的免疫抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)換為cd27介導(dǎo)的t細(xì)胞活化信號(hào)。

130、所述藥物組合物的活性成分可為本文中任一所述的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞(如claudin?18.2car-ic?t細(xì)胞)。

131、所述藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域中熟知并且通常實(shí)踐的方法制備。參見(jiàn)例如，remington:the?science?and?practice?of?pharmacy，第22版，loyd?v.allen等人編，pharmaceutical?press(2012)。所述藥物組合物優(yōu)選在gmp或cgmp條件下制造。

132、本發(fā)明還提供了用于制備car-t細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒可包括本文中任一所述的嵌合抗原受體或所述生物材料。

133、進(jìn)一步地，所述試劑盒還可包括下述試劑中的一種或幾種：淋巴細(xì)胞分離液、cd3/cd28單克隆抗體包被的磁珠(cd3/cd28磁珠)、磷酸鹽緩沖液(如杜氏磷酸鹽緩沖液)、細(xì)胞培養(yǎng)基、il-2、il-7、il-15、il-21、抗生素、細(xì)胞凍存液和病毒載體。

134、所述試劑盒的各種試劑組分可以存在于分開(kāi)的容器中，或者可以全部或部分預(yù)組合成試劑混合物。

135、所述試劑盒的組分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液狀態(tài)存在的情況下，這些成分的濃度或含量是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同需求而方便地確定的。例如，用于儲(chǔ)存的目的時(shí)，組分的濃度可以較高的形式存在，當(dāng)處于工作狀態(tài)或使用時(shí)，可通過(guò)稀釋上述較高濃度的溶液來(lái)將濃度降低至工作濃度。

136、本發(fā)明還提供了制備本文中任一所述的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括：將編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子導(dǎo)入免疫效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)，得到所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

137、進(jìn)一步地，所述導(dǎo)入的方法可包括磷酸鈣共沉淀法、陽(yáng)離子聚合物法(如deae-葡聚糖轉(zhuǎn)染法)、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、電穿孔法(即電轉(zhuǎn)染法)、顯微注射、基因槍法或病毒介導(dǎo)法(如逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、腺病毒感染法、慢病毒感染法)等但不限于此。

138、進(jìn)一步地，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可為t細(xì)胞，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可為car-t細(xì)胞。

139、進(jìn)一步地，所述car-t細(xì)胞的制備方法可包括如下步驟：

140、(1)將編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子克隆到病毒載體中，得到重組病毒載體；

141、(2)將所述重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞進(jìn)行包裝，得到重組病毒；

142、(3)將所述重組病毒感染(轉(zhuǎn)染)人的t細(xì)胞，得到所述car-t細(xì)胞。

143、進(jìn)一步地，所述核酸分子可為核苷酸序列如seq?id?no.2或seq?id?no.2的第64-3432位所示的claudin18.2car-ic基因。

144、進(jìn)一步地，所述病毒載體可包括桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)和皰疹病毒(如單純皰疹病毒)但不限于此。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒或慢病毒。

145、進(jìn)一步地，所述病毒載體可為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體mp71)。

146、進(jìn)一步地，所述包裝細(xì)胞用于包裝缺乏編碼病毒包裝所需蛋白質(zhì)的至少一種基因的病毒載體質(zhì)粒，其可為病毒包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，且其本身不能產(chǎn)生任何形式的病毒顆粒。提供病毒包裝所缺乏的蛋白質(zhì)或多肽的任何細(xì)胞都可被考慮用作包裝細(xì)胞。合適的包裝細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如eco細(xì)胞、pg13細(xì)胞、hek293細(xì)胞、cho細(xì)胞、293t細(xì)胞、293細(xì)胞、mdck細(xì)胞、nih3t3細(xì)胞、pa317細(xì)胞、cos細(xì)胞、hela細(xì)胞、vero細(xì)胞、psicrip細(xì)胞等。

147、在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述包裝細(xì)胞為pg13細(xì)胞和phoenix-eco細(xì)胞。

148、上述制備方法中，在所述步驟(1)之前還可包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)的分離提取步驟，以及t細(xì)胞的分離與活化步驟。

149、所述單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)的分離可采用本領(lǐng)域已知的密度梯度離心法分離pbmc，該方法利用細(xì)胞比重差異，通過(guò)使用蔗糖多聚體(ficoll)試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。

150、所述t細(xì)胞的分離與活化可通過(guò)偶聯(lián)磁珠的cd3/cd28單克隆抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)t細(xì)胞及其亞群的有效富集。同時(shí)，cd3是t細(xì)胞的表面標(biāo)志物，cd28是t細(xì)胞激活的第二信號(hào)，cd3/cd28磁珠還可有效激活t細(xì)胞。cd3/cd28磁珠法分離和活化t細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)已知的。

151、上述制備方法中，在所述步驟(3)之后還可包括所述car-t細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)和檢測(cè)步驟。

152、本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向患有claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病的受試者施用本文中任一所述的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞或所述藥物組合物。

153、上述方法中，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可為本文中任一所述嵌合抗原受體修飾的t細(xì)胞。

154、進(jìn)一步地，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可為本發(fā)明所述car-t細(xì)胞(如claudin18.2car-ic?t細(xì)胞)。

155、進(jìn)一步地，所述car-t細(xì)胞可以是自體的或同種異體的。

156、進(jìn)一步地，所述方法可包括如下步驟：

157、(1)從受試者(包括患者或健康志愿者)樣本(如外周血)中分離提取單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)；

158、(2)從所述pbmc中分離活化t細(xì)胞；

159、(3)利用本發(fā)明任一所述的嵌合抗原受體的基因?qū)λ鰐細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，得到car-t細(xì)胞；

160、(4)將所述car-t細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)量檢測(cè)，得到質(zhì)量合格的car-t細(xì)胞；

161、(5)將所述質(zhì)量合格的car-t細(xì)胞施用于所述患有claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病的受試者。

162、進(jìn)一步地，所述樣本可來(lái)源于外周血、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤但不限于此。

163、上述方法中，所述claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病可為claudin18.2陽(yáng)性腫瘤。

164、上述方法中，所述claudin18.2陽(yáng)性腫瘤可為claudin18.2陽(yáng)性實(shí)體腫瘤。

165、進(jìn)一步地，所述實(shí)體腫瘤可為消化系統(tǒng)腫瘤(如胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸腺癌)。

166、上述方法中，所述claudin18.2陽(yáng)性腫瘤可為claudin18.2陽(yáng)性癌癥或claudin18.2陽(yáng)性的間皮瘤。

167、上述方法中，所述癌癥選自胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸腺癌、肺癌、肺腺癌、肝癌、腎癌、卵巢癌、支氣管癌、乳腺癌、膀胱癌、頭頸癌、膽囊癌、膽管癌和胃食管交界處腺癌。

168、上述方法中，所述癌癥可包括早期癌癥、中期癌癥、中晚期癌癥、晚期癌癥、復(fù)發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥。

169、上述方法中，所述施用的量可為治療有效量。所述治療有效量可指(i)治療或預(yù)防特定疾病、病況或障礙；(ii)減輕、改善或消除特定疾病、病況或障礙的一種或多種癥狀；或(iii)預(yù)防或延遲本文中所述的特定疾病、病況或障礙的一種或多種癥狀發(fā)作的所述藥物的用量。治療有效量可以通過(guò)在已知的體外或體內(nèi)(例如動(dòng)物模型)系統(tǒng)中測(cè)試而確定。

170、進(jìn)一步地，本文所述治療有效量可為每kg體重約(0.3～35)×106個(gè)、(0.3～30)×106個(gè)、(0.3～25)×106個(gè)、(0.3～20)×106個(gè)、(0.3～15)×106個(gè)、(0.3～10)×106個(gè)、(0.3～9)×106個(gè)、(0.3～8)×106個(gè)、(0.3～7)×106個(gè)、(0.3～6)×106個(gè)、(0.3～5)×106個(gè)、(0.3～4)×106個(gè)、(0.3～3)×106個(gè)、(0.3～2)×106個(gè)、(0.3～1)×106個(gè)、(1～35)×106個(gè)、(1～30)×106個(gè)、(1～25)×106個(gè)、(1～20)×106個(gè)、(1～15)×106個(gè)、(1～10)×106個(gè)、(1～9)×106個(gè)、(1～8)×106個(gè)、(1～7)×106個(gè)、(1～6)×106個(gè)、(1～5)×106個(gè)、(1～4)×106個(gè)、(1～3)×106個(gè)、(1～2)×106個(gè)、(2～35)×106個(gè)、(2～30)×106個(gè)、(2～25)×106個(gè)、(2～20)×106個(gè)、(2～15)×106個(gè)、(2～10)×106個(gè)、(2～9)×106個(gè)、(2～8)×106個(gè)、(2～7)×106個(gè)、(2～6)×106個(gè)、(2～5)×106個(gè)、(2～4)×106個(gè)、(2～3)×106個(gè)、(4～35)×106個(gè)、(4～30)×106個(gè)、(4～25)×106個(gè)、(4～20)×106個(gè)、(4～15)×106個(gè)、(4～10)×106個(gè)、(4～9)×106個(gè)、(4～8)×106個(gè)、(4～7)×106個(gè)、(4～6)×106個(gè)或(4～5)×106個(gè)免疫效應(yīng)細(xì)胞(如本發(fā)明的car-t細(xì)胞)，優(yōu)選可為每kg體重(1～10)×106個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選每kg體重(1～9)×106個(gè)、(2～9)×106個(gè)、(1～5)×106個(gè)或(2～5)×106個(gè)免疫效應(yīng)細(xì)胞(如本發(fā)明的car-t細(xì)胞)。

171、進(jìn)一步地，所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、透皮注射、靜脈注射、動(dòng)脈注射、腹腔注射、腹膜內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、微針注射、瘤內(nèi)注射、粘膜給藥、口服、口鼻腔噴入、霧化吸入、體內(nèi)植入和體外攜帶裝置給藥。

172、優(yōu)選的施用方式(給藥途徑)是胃腸外(如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi))給藥。技術(shù)人員應(yīng)理解，給藥途徑將根據(jù)預(yù)期目的而發(fā)生變化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞(如car-t細(xì)胞)或藥物組合物可通過(guò)注射或連續(xù)輸注(包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)和門靜脈內(nèi))進(jìn)行施用。

173、在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的預(yù)防或治療方法還可與其他療法(包括手術(shù)、化療、放療、免疫療法、基因療法、dna療法、rna療法、納米療法、病毒療法、輔助療法等)聯(lián)合應(yīng)用，例如可采用第二治療劑進(jìn)行治療，所述第二治療劑可以是抗腫瘤藥物、抗炎藥物、免疫抑制劑或其他具有治療活性的藥物，包括但不限于吉非替尼、伊馬替尼、埃克替尼、索拉菲尼、英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、利妥昔單抗、依沙利鉑和氟尿嘧啶。

174、本發(fā)明所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞(如car-t細(xì)胞)或藥物組合物可與第二治療劑分開(kāi)(通過(guò)不同途徑同時(shí)或基本上同時(shí)施用)、依次(在不同時(shí)間施用，施用途徑可以相同也可以不同)或同時(shí)(通過(guò)相同途徑同時(shí)或基本上同時(shí)施用)施用于所述受試者。

175、本發(fā)明還提供了一種抑制claudin18.2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或殺傷claudin18.2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述claudin18.2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞與本文中任一所述的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞或所述藥物組合物接觸。

176、進(jìn)一步地，所述方法可為體外方法或體內(nèi)方法。

177、本發(fā)明所述用途和方法的目的可以是疾病診斷目的、疾病預(yù)后目的和/或疾病治療目的，它們的目的也可以是非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的；它們的直接目的可以是獲取疾病診斷結(jié)果、疾病預(yù)后結(jié)果和/或疾病治療結(jié)果的中間結(jié)果的信息，它們的直接目的可以是非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和/或非疾病治療目的。

178、本文所述產(chǎn)品可包括試劑、試劑盒、制劑、藥物和藥物組合物等。

179、本文所述受試者可為人類或非人類動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，所述受試者患有claudin?18.2靶點(diǎn)相關(guān)疾病。

180、本文所述非人類動(dòng)物可為非人類哺乳動(dòng)物。

181、本文所述非人類哺乳動(dòng)物可為小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、豬，犬，羊，猴，兔、貓、牛、馬中的任意一種但不限于此。

182、本技術(shù)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，設(shè)計(jì)了一種靶向claudin?18.2的嵌合抗原受體(car)。該car采用了雙表位的設(shè)計(jì)，并且融合了干擾素和嵌合轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)受體(cr)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。該car的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域由2個(gè)單域抗體通過(guò)接頭連接而成的靶向claudin18.2兩個(gè)不同表位的雙表位單域抗體構(gòu)成，主要負(fù)責(zé)識(shí)別并特異性結(jié)合腫瘤表面抗原claudin?18.2，該雙表位的設(shè)計(jì)優(yōu)化了car-t細(xì)胞親和力，能夠提升抗腫瘤效果。在car的n端帶有一段信號(hào)肽，用于引導(dǎo)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽鏈轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原claudin?18.2。鉸鏈區(qū)(hinge)連接胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，可以促進(jìn)car分子在t細(xì)胞膜表面的穩(wěn)定表達(dá)，為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供一定的靈活性，避免空間位阻影響。跨膜區(qū)(tm)用于將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域錨定在細(xì)胞膜上。胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域從n端到c端依次包括共刺激結(jié)構(gòu)域4-1bb、激活結(jié)構(gòu)域cd3ζ、ifnα、嵌合轉(zhuǎn)換受體pd-1&trii&cd27。cd3ζ和4-1bb分別為car-t細(xì)胞的活化提供第一信號(hào)和第二信號(hào)，使car-t細(xì)胞在被抗原刺激后能夠充分活化從而殺傷腫瘤細(xì)胞。ifnα用于廣譜抗瘤和重塑腫瘤免疫微環(huán)境激活免疫應(yīng)答。嵌合轉(zhuǎn)換受體pd-1&trii&cd27用于將腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制信號(hào)轉(zhuǎn)化為car-t細(xì)胞中的cd27激活信號(hào)，增強(qiáng)殺瘤效果。pd-1可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的pd-l1用于阻斷t細(xì)胞上的pd-1信號(hào)通路和抑制t細(xì)胞衰竭，trii胞外區(qū)可以結(jié)合tgfβ，阻斷tgfβ抑制通路，進(jìn)而抑制腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。本發(fā)明的設(shè)計(jì)的car賦予了car-t細(xì)胞更強(qiáng)的腫瘤殺傷能力、抵抗免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的能力，以及更強(qiáng)的體內(nèi)持久性。

183、本發(fā)明成功構(gòu)建了靶向claudin?18.2的car-t細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的car-t細(xì)胞能夠很好地分泌t細(xì)胞特異性效應(yīng)分子ifn-γ，有效地特異性殺傷claudin?18.2陽(yáng)性細(xì)胞，而對(duì)claudin?18.2陰性細(xì)胞無(wú)殺傷作用，尤其是對(duì)claudin?18.1(與claudin?18.2結(jié)構(gòu)極其相似，同源性高達(dá)92％)陽(yáng)性的細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。本發(fā)明的car-t細(xì)胞在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很好的殺傷活性，能夠有效地特異性殺傷claudin?18.2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還具有良好的體內(nèi)殺瘤活性，小鼠體內(nèi)可以顯著清除腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)，3周左右腫瘤完全消失，顯示出了在對(duì)抗claudin?18.2陽(yáng)性癌癥方面的顯著潛力，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

184、術(shù)語(yǔ)定義

185、在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。

186、術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”通常是指包含足以表達(dá)目的基因的核酸元件的核酸構(gòu)建體。典型的表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、mcs(多克隆位點(diǎn)，multiple?cloning?site)和終止子。表達(dá)盒還可以包括目的基因、標(biāo)記基因(如tk基因、dhfr基因、cat基因和neo基因)核糖體識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(sd)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(tfbs)、增強(qiáng)子、沉默子、阻遏子、內(nèi)含子、加poly(a)信號(hào)序列和/或mrna剪接信號(hào)序列等。表達(dá)盒中各元件之間可以直接連接或通過(guò)接頭間接連接。

187、術(shù)語(yǔ)“載體(vector)”通常是指能夠把外源dna或目的基因運(yùn)載進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和/或表達(dá)的載體，所述載體可以是克隆載體也可以是表達(dá)載體。載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得擴(kuò)增和/或表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)基因工程的目的和受體細(xì)胞的性質(zhì)選擇合適的載體。所述載體包括但不限于：質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage，如λ噬菌體或m13噬菌體)、黏粒(cosmid，即柯斯質(zhì)粒)、噬菌粒(phagemid)、穿梭載體(shuttle?vector，如酵母表達(dá)載體)、ti質(zhì)粒、人工染色體(如酵母人工染色體(yac)、細(xì)菌人工染色體(bac)、p1人工染色體(pac)或ti質(zhì)粒人工染色體(tac))、病毒載體(如桿狀病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)、皰疹病毒(如單純皰疹病毒))。一種載體可以含有多種控制表達(dá)的元件，包括但不限于啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。

188、術(shù)語(yǔ)“微生物”通常包括細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體、藻等。例如所述細(xì)菌可來(lái)自埃希氏菌屬(escherichia?sp.)(如大腸桿菌)、歐文氏菌屬(erwinia?sp.)、土壤桿菌屬(agrobacterium?sp.)(如根癌農(nóng)桿菌)、黃桿菌屬(flavobacterium?sp.)、產(chǎn)堿菌屬(alcaligenes?sp.)、假單胞菌屬(pseudomonas?sp.)和芽胞桿菌屬(bacillus?sp.)(如芽孢桿菌)等。所述病毒可包括輪狀病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、乳頭瘤病毒、流感病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如sv40)和皰疹病毒(如單純皰疹病毒)等。所述真菌可來(lái)自酵母菌屬(saccharomycessp.)(如釀酒酵母、甲醇酵母、畢赤酵母)、鐮刀菌屬(fusarium?sp.)、絲核菌屬(rhizoctonia?sp.)、輪枝菌屬(verticillium?sp.)、青霉屬(penicillium?sp.)、曲霉屬(aspergillus?sp.)和頭孢霉(cephalosporium?sp.)等。所述放線菌可來(lái)自鏈霉菌屬(streptomyces?sp.)(如鏈霉菌)。所述藻可來(lái)自藍(lán)藻門(cyanophyta)(如藍(lán)藻)、墨角藻屬(fucus?sp.)、曲殼藻屬(achnanthes?sp.)、繭形藻屬(amphiprora?sp.)、雙眉藻屬(amphora?sp.)、纖維藻屬(ankistrodesmus?sp.)、星胞藻屬(asteromonas?sp.)和黃金色藻屬(boekeloviasp.)等。

189、術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”也稱為受體細(xì)胞，通常是指可用于導(dǎo)入載體的任何類型的細(xì)胞，例如植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可理解為不僅是指特定的受體細(xì)胞，而且也指這種細(xì)胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的親代細(xì)胞完全一致，但仍包括在宿主細(xì)胞的范圍中。合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域已知的，其中：所述植物細(xì)胞可為擬南芥(arabidopsis?thaliana)、煙草(nicotiana?tabacum)、玉米(zea?mays)、水稻(oryza?sativa)、小麥(triticum?aestivum)等植物細(xì)胞但不限于此；所述動(dòng)物細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho細(xì)胞)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株(cho-k1細(xì)胞)、非洲綠猴腎細(xì)胞(vero細(xì)胞)、sv40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞(cos細(xì)胞)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(bhk細(xì)胞)、小鼠乳腺癌細(xì)胞(c127細(xì)胞)、人胚胎腎細(xì)胞(hek293細(xì)胞)、人hela細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞系、t細(xì)胞或nk細(xì)胞等)、禽類細(xì)胞(例如雞或鴨細(xì)胞)、兩棲類細(xì)胞(例如非洲爪蟾(xenopus?laevis)細(xì)胞或大鯢(andrias?davidianus)細(xì)胞)、魚(yú)類細(xì)胞(例如草魚(yú)、鯉魚(yú)、虹鱒魚(yú)或鯰魚(yú)細(xì)胞)、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如sf21細(xì)胞、sf-9細(xì)胞或hi-5)等但不限于此。

190、術(shù)語(yǔ)“重組載體”通常是指將外源目的基因與載體在體外連接構(gòu)建而成的重組體dna分子，可以任何合適的方式構(gòu)建，只要構(gòu)建的重組載體可攜帶外源目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞、并為外源目的基因提供在受體細(xì)胞的復(fù)制、整合、擴(kuò)增和/或表達(dá)能力即可。

191、術(shù)語(yǔ)“重組微生物”通常是指對(duì)目的微生物的基因進(jìn)行操作和修飾，從而得到功能發(fā)生變化的重組微生物。如將外源目的基因或重組載體導(dǎo)入目的微生物，或直接對(duì)目的微生物的內(nèi)源基因進(jìn)行基因編輯。

192、術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”通常是指對(duì)宿主細(xì)胞的基因進(jìn)行操作和修飾，從而得到功能發(fā)生變化的重組宿主細(xì)胞。如將外源目的基因或重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或直接對(duì)宿主細(xì)胞的內(nèi)源基因進(jìn)行基因編輯。

193、術(shù)語(yǔ)“連接”通常是指兩個(gè)或更多個(gè)分子的締合。連接可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。本文中所述連接可通過(guò)肽鍵(peptide?bond)直接連接，或通過(guò)連接子(接頭)連接。

194、術(shù)語(yǔ)“接頭(linker)”也可稱為連接肽、肽接頭或連接子，用于融合、偶聯(lián)、連接(link)或接合(join)兩個(gè)蛋白質(zhì)或多肽，可防止空間位阻。linker為兩個(gè)融合蛋白間起連接作用的氨基酸鏈，具有一定的柔性以允許兩側(cè)的蛋白完成各自獨(dú)立的功能。應(yīng)當(dāng)理解，接頭的存在是任選的，柔性接頭的長(zhǎng)度也是可以調(diào)節(jié)的，以允許融合蛋白的正確折疊或?qū)崿F(xiàn)最佳生物活性。接頭的特征及其對(duì)特定目的的適用性在本領(lǐng)域是已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獨(dú)立地選擇和優(yōu)化每個(gè)肽接頭。

195、術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”通常是指引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈(長(zhǎng)度一般為5-30個(gè)氨基酸)。本發(fā)明所述嵌合抗原受體的抗原結(jié)合區(qū)前面(n端)可帶有一段信號(hào)肽(signal)。car結(jié)構(gòu)的信號(hào)肽可引導(dǎo)抗原結(jié)合區(qū)肽鏈轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原。所述信號(hào)肽可以是來(lái)源于cd4、cd8、cd8a、cd28、cd137和gm-csf的信號(hào)肽。

196、術(shù)語(yǔ)“同一性”通常是指兩個(gè)(核苷酸或氨基酸)序列在比對(duì)中在相同位置處具有相同殘基的程度，并且通常表示為百分?jǐn)?shù)。本文所述同一性可指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。具有完全相同序列的兩個(gè)拷貝具有100％同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可使用國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同一性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如ncbi主頁(yè)網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁(yè)。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過(guò)使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，perresidue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索以對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值(％)。此外可以使用序列分析軟件(如clc?main?workbench和megaligntm)進(jìn)行測(cè)定，例如使用缺省參數(shù)的計(jì)算機(jī)程序blast，尤其是blastp或tblastn。本文所述75％以上同一性可為至少75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。本文所述80％以上的同一性可為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同一性。

197、術(shù)語(yǔ)"保守置換(保守性取代)"通常是指將一個(gè)氨基酸殘基用另一個(gè)具有相似理化性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。例如，可以在疏水側(cè)鏈氨基酸殘基間(例如met、ala、val、leu和ile)、中性親水側(cè)鏈殘基間(例如cys、ser，thr、asn和gln)、酸性側(cè)鏈殘基間(例如asp、glu)、堿性側(cè)鏈氨基酸間(例如his、lys和arg)或芳香側(cè)鏈殘基間(例如trp、tyr和phe)進(jìn)行保守置換。本領(lǐng)域己知保守置換通常不會(huì)引起蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)的顯著變化，對(duì)蛋白質(zhì)的功能通常不會(huì)產(chǎn)生質(zhì)的影響，因此能夠保留蛋白質(zhì)的生物活性。

198、術(shù)語(yǔ)“單域抗體(sdab)”也稱為納米抗體(nanobody)，通常是指只由一個(gè)h鏈v區(qū)組成的抗體，也可稱為vhh抗體。單域抗體與抗原結(jié)合的能力極其穩(wěn)定性，與完全抗體基本一致。在本文中，除非上下文明確指出，否則當(dāng)提及術(shù)語(yǔ)“單域抗體”時(shí)，其不僅包括完整單域抗體，而且包括單域抗體的抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合片段是指包含單域抗體的片段的多肽，其保持特異性結(jié)合單域抗體所結(jié)合的相同抗原的能力，和/或與單域抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗原的特異性結(jié)合，其也被稱為“抗原結(jié)合部分”。在一些實(shí)施方案中，所述單域抗體的“抗原結(jié)合片段”與全長(zhǎng)單域抗體相比可在n端或c端處截短以使其僅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架區(qū)中的一個(gè)或兩個(gè)，只要其實(shí)質(zhì)上保持抗原結(jié)合和特異性即可。

199、術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”通常是指抗體可變區(qū)中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。cdr可根據(jù)本領(lǐng)域已知的各種編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行定義，例如可按照kabat編號(hào)系統(tǒng)、chothia編號(hào)系統(tǒng)或imgt編號(hào)系統(tǒng)中的定義。對(duì)于給定的抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地鑒別各編號(hào)系統(tǒng)所定義的cdr。并且，不同編號(hào)系統(tǒng)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

200、術(shù)語(yǔ)“框架區(qū)(framework?region，fr)”通常是指抗體可變區(qū)中除了如上定義的cdr殘基以外的那些氨基酸殘基。

201、術(shù)語(yǔ)“表位”通常是指抗原上被抗體的互補(bǔ)位結(jié)合的任何抗原決定簇。包括線性表位和構(gòu)象表位。表位可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何方法確定，例如常規(guī)免疫測(cè)定法、抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法或x射線晶體學(xué)或相關(guān)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法(例如核磁共振光譜)。

202、術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”通常是指將外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞如真核受體細(xì)胞或原核受體細(xì)胞中。導(dǎo)入的方法沒(méi)有特別限制，任何已知的轉(zhuǎn)化方法只要能將目的基因(如本發(fā)明dna分子)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中即可。所述導(dǎo)入的方法可包括以下任一種：(1)通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法(如ca離子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法或金屬陽(yáng)離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等)或物理轉(zhuǎn)化法(如電穿孔轉(zhuǎn)化法)將目的基因或含有目的基因的重組載體導(dǎo)入宿主菌。(2)通過(guò)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主菌。(3)通過(guò)物理或化學(xué)方法將目的基因直接轉(zhuǎn)入植物受體細(xì)胞，如化學(xué)刺激法、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、顯微注射法、基因槍法、激光微束法、花粉管通道法、超聲波法、氣槍法和渦流法等。(4)以載體為媒介將目的基因轉(zhuǎn)入植物受體細(xì)胞，如農(nóng)桿菌ti質(zhì)粒載體(包括ti質(zhì)粒衍生的載體如共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng))介導(dǎo)法。(5)通過(guò)磷酸鈣共沉淀法、陽(yáng)離子聚合物法(如deae-葡聚糖轉(zhuǎn)染法)、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、電穿孔法(即電轉(zhuǎn)染法)、顯微注射、基因槍法或病毒介導(dǎo)法(如逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、腺病毒感染法、慢病毒感染法)等將目的基因?qū)腚x體動(dòng)物細(xì)胞(轉(zhuǎn)染)。(6)通過(guò)顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、體細(xì)胞核移植法、精子載體法或胚胎干細(xì)胞法等將目的基因?qū)朐隗w動(dòng)物細(xì)胞。

203、術(shù)語(yǔ)“claudin18.2陽(yáng)性腫瘤”通常是指表達(dá)claudin18.2蛋白的腫瘤。檢測(cè)腫瘤claudin18.2蛋白表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如可以通過(guò)基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)法(如免疫組織化學(xué)法、facs等)測(cè)定claudin18.2蛋白的表達(dá)，也可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr、northern?blotting或rna原位雜交的方法來(lái)測(cè)定claudin18.2mrna的表達(dá)。

204、術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”通常是指為了阻止或延遲疾病或病癥或癥狀在受試者體內(nèi)的發(fā)生而實(shí)施的方法。

205、術(shù)語(yǔ)“治療”通常是指為了獲得有益或所需臨床結(jié)果而實(shí)施的方法。有益或所需的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀的減輕、疾病程度的減弱、疾病范圍的縮小、疾病的穩(wěn)定(即不再惡化)、疾病進(jìn)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的改善或減輕以及緩解(不論是部分緩解還是完全緩解)，無(wú)論是可檢測(cè)還是不可檢測(cè)的。此外，治療還可以指與受試者未接受治療時(shí)的預(yù)期生存期相比延長(zhǎng)生存期。

206、術(shù)語(yǔ)“可裂解連接子(也稱為可剪切連接子)”通常是指包含裂解位點(diǎn)，以使得當(dāng)表達(dá)時(shí)可選擇性地裂解以便產(chǎn)生兩個(gè)或兩個(gè)以上產(chǎn)物的連接子。所述可裂解連接子包括p2a、f2a、t2a和e2a，或它們的任何組合，但不限于此。

207、術(shù)語(yǔ)“嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor，car)”通常是指人工構(gòu)建的融合基因編碼的跨膜分子，能引導(dǎo)免疫細(xì)胞特異性地追蹤識(shí)別和清除表達(dá)相關(guān)靶配體的腫瘤細(xì)胞，具有高度靶向性。car的基本結(jié)構(gòu)可以劃分為四部分，由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)方向，分別是胞外腫瘤抗原結(jié)合區(qū)(抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、鉸鏈區(qū)(鉸鏈結(jié)構(gòu)域)、跨膜區(qū)(跨膜結(jié)構(gòu)域)和可提供t細(xì)胞活化信號(hào)的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域)。制備嵌合抗原受體以及包含該嵌合抗原受體的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如t細(xì)胞)的方法是本領(lǐng)域已知的，可包括用至少一種編碼car的核酸分子(car基因)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)所述核酸分子。例如，可將編碼本發(fā)明的car的核酸分子構(gòu)建到表達(dá)載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)中，所述表達(dá)載體能夠在宿主細(xì)胞例如t細(xì)胞中表達(dá)，以制備所述car。

208、術(shù)語(yǔ)“嵌合轉(zhuǎn)換受體(chimeric?switch?receptor，csr)”也稱為嵌合轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)受體，通常是指通過(guò)基因工程手段，控制被修改的t細(xì)胞在受到抑制分子的抑制信號(hào)時(shí)，轉(zhuǎn)化為激活信號(hào)，使t細(xì)胞仍然能夠在抑制環(huán)境中保持攻擊力。csr通過(guò)識(shí)別抑制性受體的配體，從而將原有的免疫抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呋罨孕盘?hào)，激活免疫細(xì)胞，提升car-t細(xì)胞的抗腫瘤活性。

209、術(shù)語(yǔ)“car細(xì)胞”在本文中也稱為修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，通常是指通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，將嵌合抗原受體(car)的基因(car基因)導(dǎo)入免疫效應(yīng)細(xì)胞，將car表達(dá)在免疫效應(yīng)細(xì)胞表面，從而獲得特異性識(shí)別并殺傷靶細(xì)胞的一類基因修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。相對(duì)于car-t細(xì)胞而言，car細(xì)胞不局限于特定的受體細(xì)胞類型，car細(xì)胞可以包括car-t細(xì)胞、car-nk細(xì)胞、car-nkt細(xì)胞、car-γδt細(xì)胞、car-αβt細(xì)胞、car-調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(car-treg細(xì)胞)、car-mait細(xì)胞、car-b細(xì)胞、car-巨噬細(xì)胞(car-m細(xì)胞)、car-樹(shù)突狀細(xì)胞(car-dc細(xì)胞)、car-外周血單核細(xì)胞(car-pbmc細(xì)胞)、car-單核細(xì)胞(car-mc細(xì)胞)、car-ipsc細(xì)胞和car-psc細(xì)胞等但不限于此。

210、術(shù)語(yǔ)“car-t細(xì)胞(嵌合抗原受體t細(xì)胞)”通常是指表達(dá)嵌合抗原受體(car)的t細(xì)胞，其可以特異性地識(shí)別和殺傷表達(dá)被嵌合抗原受體識(shí)別的靶抗原的細(xì)胞。car-t細(xì)胞可通過(guò)各種載體在體外將car基因轉(zhuǎn)入t細(xì)胞中來(lái)制備。car-t細(xì)胞通過(guò)car分子特異性識(shí)別腫瘤抗原后即發(fā)生活化，通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶b、細(xì)胞因子ifn-γ等實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。car-t細(xì)胞的定義涵蓋t淋巴細(xì)胞的所有類別和亞類，包括cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)、初始t細(xì)胞、效應(yīng)t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞(包括干性記憶t細(xì)胞、中央記憶t細(xì)胞和效應(yīng)記憶t細(xì)胞)、αβt細(xì)胞、γδt細(xì)胞、自然殺傷性t細(xì)胞(natural?killer?t?cell，nkt細(xì)胞)和黏膜相關(guān)恒定t細(xì)胞(mucosal-associated?invariant?t?cells，mait細(xì)胞)等。

211、術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合區(qū)”也稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通常是指嵌合抗原受體中與靶抗原特異性結(jié)合的部分，負(fù)責(zé)腫瘤抗原的識(shí)別，可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(vl)、抗體重鏈可變區(qū)(vh)、抗體fab片段、抗體fab’片段、單鏈抗體可變區(qū)(scfv)、單域抗體(sdab)等。抗原結(jié)合區(qū)前面(n端)可帶有一段信號(hào)肽。

212、術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)(hinge)”也稱鉸鏈結(jié)構(gòu)域，通常是指用于連接胞外抗原結(jié)合區(qū)和跨膜區(qū)的任何寡肽或多肽，是car位于細(xì)胞外的一段肽鏈。選擇合適的鉸鏈區(qū)可以提高抗原識(shí)別區(qū)的柔韌性，降低抗原和car之間的空間約束，從而促進(jìn)car-t細(xì)胞與靶細(xì)胞的突觸形成。所述鉸鏈區(qū)位于跨膜區(qū)的n端和抗原結(jié)合區(qū)的c端，可來(lái)源于cd8a(cd8α)、cd4、cd5、cd7、cd28、cd134、cd137、icos、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igd、ige或igm的鉸鏈區(qū)。

213、術(shù)語(yǔ)“跨膜區(qū)(transmembrane?domain，td)”也稱跨膜結(jié)構(gòu)域，用于連接嵌合抗原受體的抗原結(jié)合區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，主要負(fù)責(zé)維持car分子在t細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。其可以是天然的或合成的，也可以源自任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白，通常由同源或異源二聚體膜蛋白組成。本發(fā)明嵌合抗原受體的跨膜區(qū)可以是本領(lǐng)域已知的任何蛋白結(jié)構(gòu)，只要其能夠在細(xì)胞膜(特別是真核細(xì)胞膜)中熱力學(xué)穩(wěn)定。所述跨膜區(qū)可來(lái)源于t細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、cd3ζ、cd8a(cd8α)、cd4、cd9、cd45、cd16、cd19、cd22、cd28、cd28t、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152或cd154的跨膜結(jié)構(gòu)域。

214、術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)信號(hào)區(qū)(也稱為胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域)”通常是指嵌合抗原受體中將抗原刺激轉(zhuǎn)化為t細(xì)胞活化信號(hào)的部分。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)可包含激活結(jié)構(gòu)域和/或共刺激結(jié)構(gòu)域。所述激活結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b或cd66d的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。所述共刺激結(jié)構(gòu)域可以是來(lái)自共刺激分子的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，例如所述共刺激結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、icam-1(cd54)、lfa-1(cd11a)、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、2b4、cd150(slamf1)、cd270(hvem)、cd278(icos)或dap10的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)可包含一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域。所述共刺激結(jié)構(gòu)域可包含所述共刺激分子的整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部分，或其功能片段?！肮泊碳し肿印笔侵冈趖細(xì)胞上與共刺激配體特異性結(jié)合，由此介導(dǎo)t細(xì)胞的共刺激反應(yīng)(例如增殖)的同源結(jié)合配偶體。

215、術(shù)語(yǔ)“免疫效應(yīng)細(xì)胞”通常是指參與免疫應(yīng)答、執(zhí)行免疫效應(yīng)功能(例如細(xì)胞毒性細(xì)胞殺傷活性、分泌細(xì)胞因子、誘導(dǎo)adcc和/或cdc)的免疫細(xì)胞。所述免疫效應(yīng)細(xì)胞包括t細(xì)胞(如cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)、初始t細(xì)胞、效應(yīng)t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞(包括干性記憶t細(xì)胞、中央記憶t細(xì)胞和效應(yīng)記憶t細(xì)胞)、αβt細(xì)胞、γδt細(xì)胞、自然殺傷性t細(xì)胞(natural?killer?t?cell，nkt細(xì)胞)和黏膜相關(guān)恒定t細(xì)胞(mucosal-associatedinvariant?t?cells，mait細(xì)胞)等)、nk細(xì)胞、b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)、外周血單核細(xì)胞(pbmc)和單核細(xì)胞(mc)。本文所述免疫效應(yīng)細(xì)胞還可包括能夠在體內(nèi)或體外被誘導(dǎo)分化為免疫效應(yīng)細(xì)胞的干細(xì)胞，例如成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)、全能干細(xì)胞或造血干細(xì)胞(hsc)。本文所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可以從干細(xì)胞分化而得，例如從成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)、全能干細(xì)胞或造血干細(xì)胞(hsc)分化而成的免疫效應(yīng)細(xì)胞。所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是自體的，也可以是非自體的(同種異體的、同基因的或異種的)，優(yōu)選是自體的或同種異體的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞是t細(xì)胞。t細(xì)胞存在于多種來(lái)源中，包括但不限于外周血、單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(例如密度梯度分離技術(shù)、黏附分離法、磁珠分離技術(shù)、流式細(xì)胞分選技術(shù)等)分離獲得t細(xì)胞。

216、術(shù)語(yǔ)“自體的”通常是指來(lái)自同一受試者的細(xì)胞。

217、術(shù)語(yǔ)“同種異體的”通常是指與比較中的細(xì)胞在遺傳上不同的相同物種的細(xì)胞。

218、術(shù)語(yǔ)“同基因的”通常是指與比較中的細(xì)胞在遺傳上相同的不同受試者的細(xì)胞。

219、術(shù)語(yǔ)“異種的”通常是指與比較中的細(xì)胞不同物種的細(xì)胞。