本發(fā)明屬于生物，具體涉及silg2蛋白在調(diào)控谷子葉夾角中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禾本科作物(如水稻、小麥、玉米)的育種經(jīng)驗(yàn)表明，通過(guò)株型改良可以大幅提高禾本科作物的種植密度，從而提高單位面積產(chǎn)量。小麥和水稻均提高了單位面積產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道，美國(guó)玉米產(chǎn)量從1930s年代開(kāi)始穩(wěn)步提高，美國(guó)的玉米種植密度也從1930s的30,000株/公頃提高到8,8000株/公頃，其種植密度的增加主要依賴于緊湊株型的廣泛應(yīng)用。

2、谷子(setaria?italica)起源于中國(guó)，脫殼后為小米，其抗旱、耐逆、適應(yīng)性廣、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)使其成為我國(guó)最大的雜糧作物。谷子作為c4作物，具有巨大增產(chǎn)潛力，但生產(chǎn)上應(yīng)用的谷子品種主要屬于大葉、披葉類(lèi)型品種。谷子育種中亟需株型改良，然而，目前谷子中已有的小葉夾角材料、突變體多帶有早衰、籽粒變小、穗型變緊等多種負(fù)面效應(yīng)。

3、silg2是sbp家族的轉(zhuǎn)錄因子，在禾本科植物中的功能保守。迄今為止，谷子中關(guān)于silg2基因功能的研究及其應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是創(chuàng)制葉夾角變小即株型緊湊的谷子新種質(zhì)。

2、本發(fā)明首先保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因谷子的方法，通過(guò)突變出發(fā)谷子中silg2蛋白的編碼基因(即silg2基因)來(lái)實(shí)現(xiàn)；

3、所述silg2蛋白為a1)或a2)或a3)：

4、a1)氨基酸序列是seq?id?no：2所示的蛋白質(zhì)；

5、a2)在a1)或a2)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

6、a3)將seq?id?no：2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的蛋白質(zhì)；

7、與出發(fā)谷子相比，轉(zhuǎn)基因谷子的葉夾角變小、株型緊湊、株高增加、粒寬增加、千粒重增加和/或葉長(zhǎng)降低。

8、上述a2)中的蛋白質(zhì)，標(biāo)簽具體如表1所示。

9、表1.標(biāo)簽的序列

10、

11、

12、上述a3)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

13、上述a3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

14、上述a3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將seq?id?no：1所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。

15、上述方法中，所述突變可為將seq?id?no：1所示的silg2基因突變?yōu)閟ilg2/+1bp；所述silg2/+1bp是將seq?id?no：1自5’末端起第259位和第260位之間插入1個(gè)a，保持seqid?no：1的其他核苷酸序列不變得到的dna分子。

16、上述方法中，所述突變出發(fā)谷子中silg2蛋白的編碼基因是通過(guò)將crispr/cas9系統(tǒng)導(dǎo)入谷子實(shí)現(xiàn)。所述crispr/cas9系統(tǒng)可包括表達(dá)靶向所述silg2蛋白的編碼基因的grna的dna分子的重組表達(dá)載體。

17、上述方法中，所述grna的靶標(biāo)序列可為seq?id?no：1自5’末端起第243-262位所示。

18、上述方法中，所述重組表達(dá)載體可為silg2敲除載體。所述silg2敲除載體可為將seq?id?no：3所示的dna雙鏈分子插入pylcrispr/cas9pubi-h載體的限制性內(nèi)切酶bsai-hf的識(shí)別位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)粒。

19、本發(fā)明還保護(hù)突變出發(fā)谷子中上述任一所述silg2蛋白的編碼基因(即silg2基因)的物質(zhì)在培育轉(zhuǎn)基因谷子中的應(yīng)用；與出發(fā)谷子相比，轉(zhuǎn)基因谷子的葉夾角變小、株型緊湊、株高增加、粒寬增加、千粒重增加和/或葉長(zhǎng)降低。

20、上述應(yīng)用中，所述突變可為將seq?id?no：1所示的silg2基因突變?yōu)閟ilg2/+1bp；所述silg2/+1bp是將seq?id?no：1自5’末端起第259位和第260位之間插入1個(gè)a，保持seqid?no：1的其他核苷酸序列不變得到的dna分子。

21、上述應(yīng)用中，所述突變出發(fā)谷子中silg2蛋白的編碼基因的物質(zhì)可為如下b1)或b2)：

22、b1)抑制或降低所述silg2蛋白的編碼基因的表達(dá)的核酸分子；

23、b2)含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

24、上述應(yīng)用中，b1)所述核酸分子可為表達(dá)靶向所述silg2蛋白的編碼基因的grna的dna分子或?yàn)榘邢蛩鰏ilg2蛋白編碼基因的grna。

25、上述應(yīng)用中，所述grna的靶標(biāo)序列可為seq?id?no：1自5’末端起第243-262位所示。

26、上述任一所述突變出發(fā)谷子中silg2蛋白的編碼基因的物質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

27、上述任一所述silg2基因可為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的dna分子：

28、(b1)編碼區(qū)如seq?id?no:1所示的dna分子；

29、(b2)核苷酸序列如seq?id?no:1所示的dna分子；

30、(b3)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的dna分子雜交且編碼上述任一所述silg2蛋白的dna分子；

31、(b4)來(lái)源于谷子且與(b1)或(b2)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼上述任一所述silg2蛋白的dna分子。

32、所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min。

33、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

34、其中，seq?id?no:1由1617個(gè)核苷酸組成，seq?id?no:1所示的核苷酸編碼seq?idno:2所示的氨基酸序列。

35、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼上述任一所述silg2蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的上述任一所述silg2蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼上述任一所述silg2蛋白，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

36、這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼氨基酸序列如seq?id?no:2所示的silg2蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

37、上述任一所述出發(fā)谷子品種具體可為谷子品種ci846。

38、實(shí)驗(yàn)證明，將silg2敲除載體轉(zhuǎn)至谷子品種ci846，能夠?qū)ilg2基因進(jìn)行基因編輯，silg2基因通過(guò)crispr/cas9核酸內(nèi)切酶編輯之后，可造成silg2基因突變，當(dāng)兩條同源染色體的silg2基因均發(fā)生突變時(shí)(具體為將seq?id?no：1所示的silg2基因突變?yōu)閟ilg2/+1bp；silg2/+1bp是將seq?id?no：1自5’末端起第259位和第260位之間插入1個(gè)a，保持seqid?no：1的其他核苷酸序列不變得到的dna分子)，可以導(dǎo)致silg2蛋白活性喪失；silg2蛋白活性喪失形成谷子新種質(zhì)。與谷子品種ci846相比，形成的谷子新種質(zhì)的葉夾角變小、株型緊湊、株高增加、粒寬增加、千粒重增加和/或葉長(zhǎng)降低。采用本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)谷子的silg2基因編輯，獲得谷子新種質(zhì)。由此可見(jiàn)，silg2蛋白可以調(diào)控谷子葉夾角、株型、株高、粒寬、千粒重和葉長(zhǎng)等，本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。