本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、磷脂(phospholipids)是所有生物體生物膜的主要成分，在自然界中廣泛存在，發(fā)揮著多種多樣的作用，具有重要的生理意義。由于磷脂所具有的獨特理化性質(zhì)和營養(yǎng)價值，磷脂在食品、保健品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)己經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。然而，在大多數(shù)應(yīng)用情況下，天然存在的磷脂要么缺乏結(jié)構(gòu)多樣性，要么數(shù)量不足；因此，必須開發(fā)新方法來合成新分子或修改磷脂的自然結(jié)構(gòu)。

2、酶法修飾改性是制備功能性磷脂的一個重要方向。磷脂酶a2(pla2，ec?3.1.1.4)是水解磷脂的sn-2位置的酯鍵，生成游離脂肪酸和相應(yīng)的溶血磷脂。與天然卵磷脂相比，pla2制備的卵磷脂不僅表現(xiàn)出乳化性能增強，而且在各種工藝條件下都能形成穩(wěn)定的乳劑。因此，溶血卵磷脂在食品、化妝品和制藥等工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。特別是，pla2可廣泛用于酶解脫膠，這是植物油和其他食用油精制的關(guān)鍵工藝。

3、目前磷脂酶a2在工業(yè)應(yīng)用中有時仍受到限制。諸如天然磷脂酶在活性、特異性和穩(wěn)定性方面不滿足實際應(yīng)用的需求，天然生產(chǎn)菌的磷脂酶產(chǎn)量不高等。因此獲得高產(chǎn)量且滿足食品安全用于功能油脂加工應(yīng)用的磷脂酶迫在眉睫。通過蛋白質(zhì)工程對酶進行改造是解決該問題的主要策略。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體及其制備方法。其中，突變體n21e，q47k，f53h，y68h，i84l，q116m，n21e/i84l，q47k/i84l，i84l/q116m，n21e/i84l/q116m和q47k/i84l/q116m的酶活力均有所提高，分別提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％；本發(fā)明獲得了高酶活的磷脂酶a2突變體，具有較大的工業(yè)應(yīng)用潛力和經(jīng)濟價值。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體，其氨基酸序列為seq?id?no.1經(jīng)如下任意一種突變而得：

4、n21e、q47k、f53h、y68h、i84l和q116m中的至少一個；其中，n21e即第21位氨基酸由n突變?yōu)閑，其他同理；

5、進一步的，紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體，其氨基酸序列為seq?id?no.1經(jīng)如下任意一種突變而得：

6、n21e；或q47k；或f53h；或y68h；或i84l；或q116m；或n21e/i84l；或q47k/i84l；或i84l/q116m；或n21e/i84l/q116m；或q47k/i84l/q116m。

7、編碼seq?id?no.1所示氨基酸序列的基因序列如seq?id?no.2所示。

8、一種所述紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體的編碼基因。

9、優(yōu)選的，一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體n21e/i84l/q116m，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。所述突變體的第21位，84位氨基酸和第116位氨基酸分別由天冬酰胺n、異亮氨酸i和谷氨酰胺q突變?yōu)楣劝彼醗、亮氨酸l和甲硫氨酸m。

10、一種酶活提高的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體n21e/i84l/q116m的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

11、上述突變體相關(guān)的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：

12、(a)含有上述編碼基因的表達盒；

13、(b)含有上述編碼基因的重組表達載體；

14、(c)含有(a)中所述表達盒的重組表達載體；

15、(d)含有上述編碼基因的重組微生物；

16、(e)含有(a)中所述表達盒的重組微生物；

17、(f)含有(b)或(c)中所述重組表達載體的重組微生物。

18、進一步的，(a)中所述表達盒使用的表達元件是：p43和pgntk雙啟動子，apre信號肽和ter終止子。

19、所述pgntk啟動子的序列如seq?id?no.5中的第1-182bp所示。

20、所述apre信號肽來源于枯草芽孢桿菌，其氨基酸序列如genbank號：wp_015383267.1中的1-29aa所示；編碼apre信號肽的基因序列如seq?id?no.5中的第183-269bp所示。

21、進一步的，(b)、(c)中所述重組表達載體的出發(fā)載體為pbe系列的載體等；優(yōu)選為pbe2-r載體、含有p43和pgntk雙啟動子的pbe載體等。

22、進一步的，(d)、(e)、(f)中所述重組微生物對應(yīng)的宿主微生物選自原核生物或酵母等；所述原核生物包括芽孢桿菌屬(bacillus)等細菌；所述酵母包括畢赤酵母等酵母。更具體而言，所述原核生物是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)，具體可為枯草芽孢桿菌atcc6051和解淀粉芽孢桿菌lb1ba02；所述酵母是畢赤酵母gs115。

23、上述突變體、編碼基因或突變體相關(guān)的生物材料在制備高酶活的磷脂酶a2突變體中的應(yīng)用。

24、上述突變體、編碼基因或突變體相關(guān)的生物材料在生產(chǎn)功能磷脂中的應(yīng)用。

25、進一步的，上述突變體、編碼基因或突變體相關(guān)的生物材料應(yīng)用于保健品、食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域和油脂精煉中。

26、一種獲得上述突變體的方法，包括如下步驟：通過設(shè)計含有突變位點的引物對編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2的基因進行定點突變后表達，得到紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體。

27、進一步的，設(shè)計含有突變位點的引物向編碼氨基酸序列如seq?id?no.1所示的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2的基因中引入突變，經(jīng)測序正確后轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌atcc6051中進行表達，得到紫紅鏈霉菌磷脂酶a2突變體。

28、本發(fā)明具體實施步驟如下：

29、1.構(gòu)建磷脂酶a2突變體重組表達載體：1)將經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成的紫紅鏈霉菌磷脂酶a2野生型基因和來源于枯草芽孢桿菌的apre信號肽連接至含有p43和pgntk雙啟動子的pbe載體上，構(gòu)建表達質(zhì)粒pbe-p43-pgntk-apre-svpla2wt；2)通過重疊pcr擴增定點突變野生磷脂酶a2，獲得相應(yīng)的磷脂酶a2突變體表達質(zhì)粒。

30、2.構(gòu)建磷脂酶a2突變體重組工程菌及以此制備高酶活的磷脂酶a2：將磷脂酶a2突變體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌atcc6051中，得到重組工程菌；之后經(jīng)發(fā)酵得到磷脂酶a2突變體。

31、3.磷脂酶a2突變體酶學(xué)性質(zhì)的表征：以2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿為底物，使用微孔比色法測定突變體的酶學(xué)性質(zhì)。

32、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

33、本發(fā)明共獲得了11個酶活力提高的突變體，包括6個單位點突變的突變體及5個組合突變體；相較于野生型，突變體n21e，q47k，f53h，y68h，i84l，q116m，n21e/i84l，q47k/i84l，i84l/q116m，n21e/i84l/q116m和q47k/i84l/q116m的酶活力均有所提高，分別提升了32.3％，20.2％，27.9％，20.5％，69.7％，60.5％，106.6％，92.9％，213.2％，406.5％，304.3％。本發(fā)明獲得的突變體酶活力得到顯著提高，磷脂酶a2酶活力提升進一步提升了該酶的工業(yè)利用價值。