本發(fā)明涉及dna檢測領域，尤其涉及一種寡聚核苷酸熒光探針及利用其進行環(huán)境dna檢測方法。

背景技術：

1、環(huán)境dna檢測（environmental?dna，edna?）是一種從水和沉積物等環(huán)境樣本中提取到特定生物物種的dna，監(jiān)測特定水生生物物種豐富度的技術。該技術需要使用核酸探針對提取到的生物物種dna進行檢測。在多種核酸探針中，含有熒光標記的熒光探針結構是dna檢測中一種重要的探針類型。探針中的熒光單元通過和目標序列結合形成雙鏈或者其他二級結構，來控制熒光的產生、淬滅或檢測波長的改變，實現(xiàn)對目標序列的檢測。核酸熒光探針具有高靈敏度、高特異性、響應時間短、操作簡單以及成本較低的優(yōu)勢。

2、目前用于核酸探針的熒光發(fā)射單元主要有羅丹明類染料（如下式a所示）、花菁類染料（如下式b所示）以及香豆素類染料（如下式c所示）。

3、

4、但是，目前的熒光探針穩(wěn)定性較差，因此寡聚核苷酸熒光探針以及環(huán)境dna檢測方法仍有待改進。

技術實現(xiàn)思路

1、為了提高雙鏈核酸探針的熱穩(wěn)定性，本發(fā)明提供了一種寡聚核苷酸熒光探針及其應用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，連接熒光單元和核酸之間的化學結構對于雙鏈核酸探針的熱穩(wěn)定性有著重要影響，提高雙鏈核酸探針的熱穩(wěn)定性，也即提高熒光類核酸探針與被檢測edna之間的熔點，對于提高核酸探針對于edna的檢測效率具有重要價值。本技術通過采用含有絲氨醇結構的連接單元，特別是含有絲氨醇結構和丁二酸結構的連接單元連接固相載體和熒光單元，將羅丹明類熒光結構以酰胺鍵和酯鍵的化學結構連接到多孔玻璃微球上，可得到3’端修飾羅丹明類熒光單元的寡聚核苷酸熒光探針，該探針熔點有較為明顯增加，熱穩(wěn)定性提升，提高了熒光探針的檢測效率。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種寡聚核苷酸熒光探針。該寡聚核苷酸熒光探針用于環(huán)境dna檢測，其中：寡聚核苷酸熒光探針的3’端含有羅丹明類熒光單元，所述寡聚核苷酸熒光探針是通過修飾有羅丹明類熒光單元的固相載體得到的，所述固相載體包括多孔玻璃微球并具有如下結構：

3、，

4、其中，所述多孔玻璃微球的表面修飾的官能團為伯氨基；

5、x1至x11各自獨立的選自h、羰基、氧代羰基、烷氧基、鹵素、氨基、取代或未取代的烷基以及酯基。

6、在本發(fā)明的一個實施例中，x1至x11各自獨立地選自以：氫原子、氧代羰基甲基、氧代羰基乙基、氧代羰基異丙基、氧代羰基叔丁基、氧代羰基苯基、氧代羰基4-甲基苯基、氧代羰基4-氯苯基、甲氧基、乙氧基、異丙氧基、叔丁氧基、苯氧基、2-甲基苯氧基、3-甲基苯氧基、4-甲基苯氧基、4-苯基苯氧基、氟原子、氯原子、溴原子、氨基、氧代羰基甲基氨基、二甲基氨基、二乙胺基、n-（二亞甲基）n-（二亞甲基）、n-（二亞甲基）n-（三亞甲基）、n-（三亞甲基）n-（三亞甲基）、n-（三亞甲基）n-（四亞甲基）、n-（1-甲基亞甲基-亞甲基）n-（1-甲基亞甲基-亞甲基）、n-（雙1-甲基亞甲基）n-（雙1-甲基亞甲基）、n-（1-甲基亞甲基-二亞甲基）n-（三亞甲基）、n-（1-甲基亞甲基-二亞甲基）n-（1-甲基亞甲基-二亞甲基）、n-（1、1-二甲基亞甲基-二亞甲基）n-（三亞甲基）、n-（1、1-二甲基亞甲基-二亞甲基）n-（1、1-二甲基亞甲基-二亞甲基）、環(huán)丙胺基、環(huán)丁胺基、環(huán)戊胺基、環(huán)己胺基、環(huán)庚胺基、甲硫基、乙硫基、羧酸甲酯基、羧酸乙酯基、羧酸丙酯基、羧甲基異丙酯基、羧酸叔丁酯基、羧酸芐酯基、羧甲基甲酯基、羧甲基乙酯基、羧甲基丙酯基、羧甲基異丙酯基、羧甲基叔丁酯基、羧甲基芐酯基、羧乙基甲酯基、羧乙基乙酯基、羧乙基丙酯基、羧乙基異丙酯基、羧乙基叔丁酯基、羧乙基芐酯基、羧丙基甲酯基、羧丙基乙酯基、羧丙基丙酯基、羧丙基異丙酯基、羧丙基叔丁酯基、羧丙基芐酯基、甲酰胺基、乙酰氨基、丙酰胺基、丁酰胺基、甲酯基、乙酯基、丙酯基、磺酸基、亞甲基羧基甲酯基、亞甲基羧基乙酯基、亞甲基羧基丙酯基、亞甲基羧基叔丁酯基、亞甲基羧基芐酯基、亞乙基羧基甲酯基、亞乙基羧基乙酯基、亞乙基羧基丙酯基、亞乙基羧基叔丁酯基、亞乙基羧基芐酯基、磷酸二甲酯基、磷酸二乙酯基、磷酸二苯酯基、磷酸二（2-氰乙基）酯基、磷酸二（三氯甲基）酯基和磷酸二（三氯甲基亞甲基）甲酯基。

7、本發(fā)明為以絲氨醇結構作為連接單元的羅丹明熒光染料修飾的固相載體具有更短的連接單元，因此得到的3’端修飾得到寡聚核苷酸熒光探針的核苷酸與羅丹明類熒光單元距離短，熔點高，熱穩(wěn)定性好，能夠有效提高熒光探針的檢測效率。

8、作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，羅丹明類熒光單元為6-羧基熒光素，所述固相載體具有如下結構：

9、。

10、在本發(fā)明的一個實施例中，所述寡聚核苷酸熒光探針中的核苷酸單元包括以下結構的至少之一：

11、糖環(huán)上修飾的天然及非天然核酸，所述糖環(huán)為天然脫氧核糖、天然核糖、2’-甲氧基取代的脫氧核糖、2’-氟取代的脫氧核糖、2’-甲氧基乙基取代的脫氧核糖、2’-甲胺基-2-氧乙基取代的脫氧核糖、2’-炔丙氧基取代的脫氧核糖、2’-丁氧基取代的脫氧核糖、2’-己氧基取代的脫氧核糖、2’-辛氧基取代的脫氧核糖、2’-癸氧基取代的脫氧核糖、2’-十二烷基氧基取代的脫氧核糖、2’-十四烷基氧基取代的脫氧核糖、2’-十六烷基氧基取代的脫氧核糖、2’-十八烷基氧基取代的脫氧核糖、2’-二十烷基氧基取代的脫氧核糖、2’-氧基-4’碳基亞甲基鎖構型的脫氧核糖、2’-氧基-4’碳基乙烯基鎖構型的脫氧核糖、2’-氧基-4’碳基-s-構型乙基鎖構型的脫氧核糖、2’-氧基-4’碳基-r-構型乙基鎖構型的脫氧核糖、2’-氟取代的阿拉伯糖、2’-甲氧基取代的阿拉伯糖、l-構型脫氧核糖、l-構型核糖、3’和5’鏈接翻轉的脫氧核糖、3’和5’鏈接翻轉的核糖；

12、堿基上修飾的天然及非天然核酸，所述堿基為尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、二氫尿嘧啶、四氫尿嘧啶、假尿苷、n-甲基假尿苷；

13、連接單元上修飾的天然及非天然核酸，所述連接單元為外消旋的硫代磷酸二酯鍵、r構型的硫代磷酸二酯鍵、s構型的硫代磷酸二酯鍵、次磷酸單甲酯、次磷酸單乙酯、次磷酸單丙酯、次磷酸單丁酯、次磷酸單戊酯、次磷酸單己酯、次磷酸單庚酯、次磷酸單辛酯；

14、連接核苷及磷酸的非天然結構，包括2’，3’-雙脫氧-β-d-吡喃葡萄糖基，其中堿基在6-β位；2-羥甲嗎啉，其中堿基在6-位；1-羥基-s-2-羥基-3-亞甲基單元，其中堿基在3-位；1-羥基-r-2-羥基-3-亞甲基單元，其中堿基在3-位；s-1，3-二羥甲基-2-亞甲基單元，其中堿基在2-位；r-1，3-二羥甲基-2-亞甲基單元，其中堿基在2-位；解鎖核酸單元，其結構為2’和3’之間沒有化學鍵的類rna結構，其中堿基在1’-β位。

15、在本發(fā)明的一個實施例中，所述寡聚核苷酸的長度為2-240個核苷酸。

16、在本發(fā)明的一個實施例中，所述寡聚核苷酸的長度為20-160個核苷酸。

17、在本發(fā)明的一個實施例中，所述寡聚核苷酸可為如下結構：

18、，

19、其中，y1，y2，y3，y4，y5，y6，y7，y8，y9，y10，y11中官能團包括但不限于氫原子，羥基，甲氧基，乙氧基，異丙氧基，叔丁氧基，苯氧基，2-甲基苯氧基，3-甲基苯氧基，4-甲基苯氧基，4-苯基苯氧基，氟原子，氯原子，溴原子，氨基，甲基氨基，二甲基氨基，二乙胺基，n-（二亞甲基）n-（二亞甲基），n-（二亞甲基）n-（三亞甲基），n-（三亞甲基）n-（三亞甲基），n-（三亞甲基）n-（四亞甲基），n-（1-甲基亞甲基-亞甲基）n-（1-甲基亞甲基-亞甲基），?n-（雙1-甲基亞甲基）n-（雙1-甲基亞甲基），n-（1-甲基亞甲基-二亞甲基）n-（三亞甲基），?n-（1-甲基亞甲基-二亞甲基）n-（1-甲基亞甲基-二亞甲基），?n-（1，1-二甲基亞甲基-二亞甲基）n-（三亞甲基），?n-（1，1-二甲基亞甲基-二亞甲基）n-（1，1-二甲基亞甲基-二亞甲基），環(huán)丙胺基，環(huán)丁胺基，環(huán)戊胺基，環(huán)己胺基，環(huán)庚胺基，甲硫基，乙硫基，羧基，羧甲基，羧乙基，羧丙基，甲酰胺基，乙酰氨基，丙酰胺基，丁酰胺基，甲酯基，乙酯基，丙酯基，磺酸基，亞甲基羧基，亞乙基羧基，磷酸基，等上述一種或幾種官能團的組合。

20、在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種利用前述寡聚核苷酸熒光探針進行環(huán)境dna檢測方法。該方法包括：提供寡聚核苷酸熒光探針，所述寡聚核苷酸熒光探針為前面所述的寡聚核苷酸熒光探針；將所述待測樣品和所述寡聚核苷酸熒光探針混合進行雜交反應；捕捉經過所述雜交反應的寡聚核苷酸熒光探針，并計算確定所述待測樣品中待檢測的dna含量。

21、在本發(fā)明的一個實施例中，所述提供寡聚核苷酸熒光探針包括根據待測樣品中待檢測的dna設計寡聚核苷酸熒光探針，所述提供寡聚核苷酸熒光探針包括以下步驟：確定所述待檢測的dna的檢測區(qū)域，并選擇標記序列；根據所述標記序列確定所述寡聚核苷酸熒光探針的序列，進行合成核苷酸并修飾，所述合成核苷酸并修飾包括：采用修飾有羅丹明類熒光單元的固相載體，得到3’端修飾有熒光單元的所述寡聚核苷酸熒光探針。

22、在本發(fā)明的一個實施例中，所述固相載體是通過以下步驟獲得的：提供含羅丹明類熒光單元的化合物；將所述含羅丹明類熒光單元的化合物與多孔玻璃微球混合并在所述多孔玻璃微球和所述含羅丹明類熒光單元的化合物之間形成連接單元，所述多孔玻璃微球表面為經過氨基修飾的，所述連接單元包括絲氨醇結構。

23、在本發(fā)明的一個實施例中，所述多孔玻璃微球的粒徑為10-100微米，微孔孔徑為500-1000埃，所述多孔玻璃微球的表面修飾的含有羅丹明類熒光單元的化合物的負載量為30-120微摩爾/克。

24、優(yōu)選地，所述多孔玻璃微球的粒徑為10-100微米，微孔孔徑為500-1000埃，所述多孔玻璃微球的表面修飾的含有羅丹明類熒光單元的化合物的負載量為30-120微摩爾/克。

25、進一步優(yōu)選地，所述多孔玻璃微球的微孔孔徑為500埃，表面修飾的含有羅丹明類熒光單元的化合物的負載量為40-120微摩爾/克，優(yōu)選為58微摩爾/克。

26、優(yōu)選地，所述多孔玻璃微球的微孔孔徑為1000埃，表面修飾的含有羅丹明類熒光單元的化合物的負載量為35-110微摩爾/克，優(yōu)選為55微摩爾/克。

27、通常情況下，微孔孔徑越小，負載量越大，能合成的探針越多，長度越短，微孔孔徑越大，能合成較長的探針，但總量較少。以上技術方案，通過選擇合適的微球粒徑、微孔孔徑，使得探針合成收率和負載量均處于較優(yōu)的水平。

28、通過上述技術方案，本發(fā)明實現(xiàn)了以下有益效果：

29、1、本發(fā)明為以絲氨醇結構作為連接單元的羅丹明熒光染料修飾的固相載體具有更短的連接單元，可用于dna、rna、含有非天然核苷酸單元的人工合成核苷酸、含有天然核苷酸單元的人工合成核苷酸的3’端修飾得到寡聚核苷酸熒光探針，該探針的核苷酸與羅丹明類熒光單元雖然距離短，但是其熔點高，熱穩(wěn)定性好，能夠有效提高熒光探針的檢測效率。

30、2、在本發(fā)明的一個優(yōu)選技術方案中，通過選擇合適的微球粒徑、微孔孔徑，使得探針合成收率和負載量均處于較優(yōu)的水平。