本發(fā)明屬于醫(yī)藥原料生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及一種固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法。

背景技術(shù)：

1、薯蕷皂素廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域，其主要作為多種類固醇激素的主要前體，被稱為“藥用黃金”。薯蕷皂素具有許多藥理特性，如降低膽固醇、治療糖尿病、抗炎癥和抑制癌性腫瘤等。工業(yè)生產(chǎn)中，薯蕷皂素通過直接酸水解植物盾葉薯蕷根莖(dioscoreazingiberensis?c.h.wright，dzw)生產(chǎn)，在這個(gè)過程中需要經(jīng)過大量的強(qiáng)酸強(qiáng)堿在高溫下進(jìn)行工業(yè)水解得到的。

2、目前，提高皂素產(chǎn)量的方法包括酸的再利用、使用離子液體代替鹽酸、亞臨界水萃取、醇解與固體酸法相結(jié)合等。盡管這些方法在皂素生產(chǎn)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力，但它們在實(shí)現(xiàn)綠色低碳發(fā)展方面仍存在一些局限性。具體而言，熱水解過程、離子液體和固體酸的合成制備過程以及所需的高溫高壓操作條件，均可能導(dǎo)致顯著的能源消耗和環(huán)境負(fù)荷。這些問題不僅增加了生產(chǎn)成本，而且可能引發(fā)二次污染，與綠色化學(xué)和可持續(xù)發(fā)展的原則相悖。因此，為了實(shí)現(xiàn)皂素生產(chǎn)的環(huán)境友好性和能效提升，未來的研究和技術(shù)開發(fā)應(yīng)著重于優(yōu)化這些方法，以降低能耗、減少環(huán)境污染，并提高整體的可持續(xù)性。

3、生物轉(zhuǎn)化法是一種利用生物體(如微生物、酶等)將原料轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物的方法。在生產(chǎn)皂素方面，生物轉(zhuǎn)化法具有環(huán)保、高效等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。酶解法制取皂素避免了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，然而，酶解法中存在酶純化繁瑣的步驟、商品酶的成本價(jià)格高昂以及生產(chǎn)過程中對產(chǎn)物的抑制作用等缺點(diǎn)。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，酶解法的投資成本高，限制了其在工業(yè)發(fā)展中的進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用。微生物轉(zhuǎn)化法是酶水解盾葉薯蕷生產(chǎn)皂素的生物轉(zhuǎn)化升級技術(shù)。微生物會(huì)自發(fā)分泌不同的酶來適應(yīng)生存環(huán)境，減少了代謝過程中對產(chǎn)物的抑制作用。微生物轉(zhuǎn)化法對環(huán)境友好，無污染，條件溫和且工藝簡單。但是微生物轉(zhuǎn)化法制取皂素的含量與中試化水平仍存在一定的差距。在實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化法制取皂素的工業(yè)化應(yīng)用中，提升皂素產(chǎn)量的效率是研究的核心焦點(diǎn)。當(dāng)前，亟需攻克微生物轉(zhuǎn)化過程中皂素產(chǎn)量提升的關(guān)鍵技術(shù)難題，以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的顯著增加。這不僅將為皂素的商業(yè)化生產(chǎn)提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐，而且將推動(dòng)產(chǎn)業(yè)向更加可持續(xù)和環(huán)境友好型的方向發(fā)展。此外，開發(fā)新型的綠色皂素生產(chǎn)方法，將有助于開拓更廣闊的市場前景，并帶來顯著的經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的科學(xué)研究價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用潛力。

4、本發(fā)明以2016.07.20日公開號為cn105779306a的一種產(chǎn)皂苷酶的盾葉薯蕷內(nèi)生菌及應(yīng)用(專利號：zl201610221146.8)中的黃曲霉菌菌株syfx213.2作為發(fā)酵菌，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素。本發(fā)明中所用syfx213.2的保藏信息如下：保藏于cgmcc，保藏編號為cgmcc11517。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明旨在開發(fā)一種環(huán)境友好、無污染，但要實(shí)現(xiàn)高效、可持續(xù)的薯蕷皂素生產(chǎn)方法。

2、為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法。

3、一方面，本發(fā)明提供了一種固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法，包括以下步驟：

4、(1)菌種活化培養(yǎng)：采用菌餅法活化培養(yǎng)syfx213.2；

5、(2)種子液培養(yǎng)：將活化好的syfx213.2制成單孢子懸液，將單孢子懸液接入未使用的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到一級種子液；將一級種子液接入未使用的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到二級種子液；

6、(3)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：將二級種子液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

7、(4)薯蕷皂素提取分離：將發(fā)酵產(chǎn)物粉碎后用石油醚提取，重復(fù)提取三次，得到薯蕷皂素粗品。

8、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的菌餅法包括挑取保藏syfx213.2菌落中長勢均勻的平板進(jìn)行打孔，得到菌塊；將菌塊倒置于打好孔的pda培養(yǎng)基平板中，并于33℃活化培養(yǎng)3～5d。

9、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的pda培養(yǎng)基成分為：馬鈴薯100～300g/l，葡萄糖10～30g/l，瓊脂粉10～30g/l，溶劑為蒸餾水。

10、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的種子培養(yǎng)基成分為：蔗糖4.48g/l，牛肉膏1.04g/l，薯蕷根莖粉末7.06g/l，k2hpo4?0.75g/l，mgso4?0.25g/l，kcl?0.25g/l，溶劑為蒸餾水。

11、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法中，單孢子懸液濃度為1～1.2×107cfu/ml，所述單孢子懸液接入未使用的種子培養(yǎng)基的接種量為5％。

12、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法中，一級種子液的培養(yǎng)時(shí)間為24h，一級種子液的培養(yǎng)溫度為33℃；二級種子液的培養(yǎng)時(shí)間為48h，一級種子液的培養(yǎng)溫度為33℃。

13、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：蔗糖5.5％、(nh4)h2po40.6％、麥麩皮26.6％、豆油0.1％、油酸0.029％、mnso4?0.15％、薯蕷根莖粉末80g。

14、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法中，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為7d，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)每兩天攪拌一次。

15、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法中，二級種子液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為50％。

16、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)薯蕷皂素的方法中，所述石油醚提取包括取粉碎后的發(fā)酵產(chǎn)物加入石油醚，超聲提取，震蕩3～5次，再進(jìn)行機(jī)械提取。

17、具體地，超聲提取時(shí)間為40min；所述機(jī)械提取為置于搖床以180rpm/min提取3h。

18、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了薯蕷皂素濃度測定的方法，將薯蕷皂素粗品制成樣品后，將樣品注入高效液相色譜儀中，機(jī)器運(yùn)行得到色譜圖。每個(gè)樣品重復(fù)三次。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到皂素含量。

19、進(jìn)一步地，本發(fā)明通過改變固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的營養(yǎng)配比，發(fā)現(xiàn)對syfx213.2生長代謝有明顯的變化，主要表現(xiàn)在發(fā)酵過程中的現(xiàn)象和皂素產(chǎn)量上。通過對增效碳氮源種類、金屬離子、氧載體和誘導(dǎo)因子的單因素優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)菌絲體的生長速度和孢子生成速度有著明顯的加快。當(dāng)添加氧載體(油酸)，金屬離子(mnso4)和誘導(dǎo)因子(豆油)，會(huì)對皂素的產(chǎn)量有大幅度提高。

20、進(jìn)一步地，本發(fā)明在培養(yǎng)基中所用誘導(dǎo)物為薯蕷根莖粉末，粉末中除含有薯蕷皂苷外，還有大量的纖維素和淀粉。所以薯蕷根莖粉末作為菌種的碳源使用；為菌種的發(fā)酵提供前體物質(zhì)；可誘導(dǎo)syfx213.2發(fā)酵產(chǎn)生皂素。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具備下述的有益效果或優(yōu)點(diǎn)：

22、本發(fā)明篩選到的一株內(nèi)生黃曲霉syfx213.2為試驗(yàn)菌株，采用微生物轉(zhuǎn)化方式，對其進(jìn)行薯蕷皂素的生產(chǎn)研究。這種方式相較于直接酸水解，其最大的優(yōu)點(diǎn)和開發(fā)優(yōu)勢，是在薯蕷皂素生產(chǎn)過程中，去掉強(qiáng)酸水解的步驟，解決環(huán)境污染嚴(yán)重的問題。同時(shí)，本發(fā)明提供的薯蕷皂素生產(chǎn)方法操作簡單，也解決了設(shè)備、操作工藝復(fù)雜的問題。

23、本發(fā)明采用的固態(tài)發(fā)酵相比于液態(tài)發(fā)酵具有能耗低、成本低、基質(zhì)利用率高等特點(diǎn)，大大節(jié)約了水資源的消耗并且發(fā)酵完畢后沒有廢水的產(chǎn)生。而且在固態(tài)靜置發(fā)酵時(shí)，真菌更易產(chǎn)生豐富的酶系統(tǒng)，生成更多的次生代謝產(chǎn)物。

24、本發(fā)明使用的syfx213.2菌株，可以直接對薯蕷皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成薯蕷皂素。在薯蕷皂素的分離過程中，僅需使用對薯蕷皂素溶解度大的石油醚，就可萃取出所需薯蕷皂素，避免了強(qiáng)酸的使用，進(jìn)一步減少了對環(huán)境的污染。