本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)和植物育種領(lǐng)域，具體涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因在調(diào)控種子耐貯性和萌發(fā)期耐鹽性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻種子活力與種子貯藏條件等因素密切相關(guān)，很大程度上決定了幼苗生長(zhǎng)狀況及對(duì)逆境的耐受性。在種子貯藏過程中的高溫和高濕環(huán)境會(huì)導(dǎo)致種子活力下降，表現(xiàn)為發(fā)芽率降低、幼苗生長(zhǎng)異常等現(xiàn)象，且對(duì)逆境耐受性降低。沿海地區(qū)水稻直播技術(shù)推廣過程主要面臨鹽漬脅迫，對(duì)種子發(fā)芽和幼苗建成產(chǎn)生負(fù)面影響。

2、提升種子活力是提升作物生產(chǎn)力和適應(yīng)性的關(guān)鍵策略之一。然而，目前水稻中克隆的調(diào)控種子活力相關(guān)基因較少，分子機(jī)制也不清楚。此外，種子萌發(fā)、耐貯性和萌發(fā)過程耐鹽性之間存在關(guān)聯(lián)性，如利用基因啟動(dòng)子或編碼區(qū)的不同等位變異來調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平和蛋白活性，對(duì)提高或平衡種子萌發(fā)、耐貯性和萌發(fā)期耐鹽性等具有重要的意義，相關(guān)研究為培育高種子活力的水稻品種提供優(yōu)異種質(zhì)資源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因在調(diào)控種子耐貯性和萌發(fā)期耐鹽性的應(yīng)用。通過過表達(dá)和crispr/cas9技術(shù)活力不同表達(dá)水平 osrav1轉(zhuǎn)基因材料，發(fā)現(xiàn) osrav1過表達(dá)材料可以提高種子貯藏后種子活力、直播條件下種子的成苗率及耐鹽性，這為培育適宜直播的高種子活力的水稻提供了新的基因資源，這對(duì)耐貯藏、適宜直播和耐鹽性的水稻品種選育具有重要意義。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因在調(diào)控水稻種子耐貯性和萌發(fā)期耐鹽性中的應(yīng)用。

4、所述調(diào)控水稻萌發(fā)期耐鹽性為提高水稻鹽脅迫條件下水稻種子的發(fā)芽率及水稻萌芽期的成苗率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根干重和芽干重。

5、本發(fā)明還提供水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因在調(diào)控水稻直播出苗率中的應(yīng)用。

6、優(yōu)選的，所述的 osrav1基因的核酸序列如seq?id?no.1所示；編碼的氨基酸序列如seq?id?no.11所示。

7、本發(fā)明還提供一種調(diào)控水稻種子活力的方法，在水稻中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株并得到高種子活力的水稻品種，所述水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因的核酸序列如seq?id?no.1所示。

8、優(yōu)選的，所述調(diào)控水稻種子活力為提高水稻種子活力。

9、優(yōu)選的，所述調(diào)控水稻種子活力為提高老化處理后水稻種子的發(fā)芽速率和最終發(fā)芽率。

10、優(yōu)選的，所述調(diào)控水稻種子活力為提高鹽脅迫條件下水稻種子的發(fā)芽率及提高鹽脅迫狀態(tài)下水稻萌芽期的成苗率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根干重和芽干重。

11、優(yōu)選的，所述獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株包括：將帶有osrav1編碼區(qū)片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)細(xì)胞，侵染水稻種子愈傷組織，通過潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。

12、優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因水稻植株的鑒定引物如seq?id?no.2~5所示。

13、一種調(diào)控水稻種子活力的方法，所述方法包括在水稻中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因，從而提高種子活力。利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，獲得水稻 osrav1基因的敲除轉(zhuǎn)基因水稻植株，其種子活力就會(huì)降低，所述水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因的核酸序列如seq?idno.1所示。

14、水稻中過量表達(dá)表達(dá) osrav1基因的方法，包括如下步驟：

15、（1）以日本晴cdna為模板，設(shè)計(jì)同源重組引物，利用高保真酶擴(kuò)增 osrav1編碼區(qū)序列；

16、（2）將（1）中獲得的純化產(chǎn)物，克隆到pb1301ubinos-osrav1-3ha載體，獲得重組質(zhì)粒；

17、（3）將（2）帶有 osrav1編碼區(qū)片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 eha105感受態(tài)細(xì)胞，侵染水稻種子愈傷組織，通過潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株；

18、（4）步驟（3）中引物序列為:

19、hm-f:?gcttctgcgggcgatttgtgt（seq?id?no.2）

20、hm?-r:?ggtcgcggaggctatggatgc（seq?id?no.3）

21、（5）利用qrt-pcr鑒定轉(zhuǎn)基因植株，引物為 osrav1-f:?gtggagccgattcgtgagggag（seq?idno.4）， osrav1-r:?cgtcgacggttgccaggttgtt（seq?idno.5）

22、水稻中敲除 osrav1基因的方法，包括如下步驟：

23、靶向敲除水稻轉(zhuǎn)錄因子 osrav1基因的方法，采用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，選取 osrav1基因的靶點(diǎn)序列以及相應(yīng)的上游引物和下游引物，先后構(gòu)建中間載體和最終載體；將最終載體侵染水稻愈傷組織，獲得水稻 osrav1基因的敲除轉(zhuǎn)基因水稻植株，即完成水稻 osrav1基因的靶向敲除。

24、（1）所述的靶點(diǎn)序列為 osrav1基因的第一外顯子上的一段長(zhǎng)度為20np的片段，靶點(diǎn)序列為gctcgtccacggacaagctg（seq?id?no.6）。

25、（2）所述上游引物的核苷酸序列為ggacatccgtccgtactggggtag（seq?id?no.7），所述下游引物的核苷酸序列為aaacgcttcggtatgacgagcctg（seq?id?no.8）。

26、（3）中間載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：1.利用限制性內(nèi)切酶aari對(duì)中間載體sk-grna進(jìn)行酶切；2.將上下游引物等比例混合后，100℃變性5分鐘，室溫冷卻后形成帶有粘性末端的片段；3.通過t4連接酶，將酶切后的sk-grna載體和帶有粘性末端的片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 dh5α感受態(tài)細(xì)胞，得到含有目標(biāo)片段的中間載體sk-grna- osrav1。

27、（4）最終載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：1.利用限制性內(nèi)切酶 kpni和 bamhi對(duì)最終載體?pc1300-cas9進(jìn)行酶切，形成帶有粘性末端的載體；2.將上述步驟獲得的中間載體sk-grna- osrav1用限制性內(nèi)切酶 kpni和 bglii進(jìn)行酶切，并回收片段；3.將帶有粘性末端的pc1300-cas9載體和上述片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 dh5α感受態(tài)細(xì)胞，通過測(cè)序檢測(cè)獲得含有靶點(diǎn)序列的最終載體pc1300-cas9-grna- osrav1。

28、（5）將（4）構(gòu)建成功的最終載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 eha105感受態(tài)細(xì)胞，侵染水稻愈傷組織，通過潮霉素和pcr篩選獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。

29、（6） osrav1測(cè)序特異性引物 osrav1-f：atccgtccgtactggggtag；（seq?id?no.9）和 osrav1-r：gcttcggtatgacgagcctg（seq?id?no.10）。對(duì)上述轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行測(cè)序篩選，最終獲得了缺失5個(gè)堿基“acaag”的突變體株系 osrav1-1和插入1個(gè)堿基“g”的突變體株系 osrav1-2（圖1）。

30、有益效果

31、本發(fā)明的 osrav1基因及其編碼蛋白可用于調(diào)控水稻種子耐貯性和萌發(fā)期耐鹽性。在種子經(jīng)過人工老化處理后，過表達(dá)種子發(fā)芽率顯著大于野生型，而敲除株系則相反。在ck處理中，過表達(dá)株系的根長(zhǎng)和干重顯著大于野生型；在0.5%?nacl鹽土處理中，兩個(gè)過表達(dá)株系成苗率分別提高了68.54%和133.90%，根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根干重和芽干重也顯著大于野生型，而敲除株系則相反。因此，本發(fā)明可以用來解決種子貯藏后萌發(fā)活力下降的問題，提高水稻直播過程成苗率和鹽脅迫耐受性，具有廣闊的應(yīng)用前景。