本發(fā)明涉及分子生物學，具體涉及一種肺癌耐藥診斷的生物標志物，尤其涉及一種mirna在制備用于肺癌耐藥診斷產(chǎn)品中的用途。

背景技術(shù)：

1、目前，肺癌最常用的治療方法是手術(shù)聯(lián)合化療，常用的化療藥物包括順鉑(cis-dichlorodiamine-platinum，ddp)和紫杉烷類。其中，ddp通過靶向dna和拓撲異構(gòu)酶ii(type?ii?topoisomerase,topo?ii)，抑制腫瘤細胞dna的合成和修復，誘導細胞凋亡，達到抑制腫瘤細胞生長的作用。以鉑類為基礎的化療在非小細胞肺癌的治療中，早期能提高治愈率，晚期能延長生存期，然而一旦出現(xiàn)藥物耐藥就很難取得令人滿意的治療效果。肺癌患者的ddp耐藥率為63％，嚴重影響了患者的預后和生存質(zhì)量。因此，探討肺癌順鉑耐藥的生物標志物，開發(fā)新的順鉑耐藥診斷檢測試劑盒，可對肺癌的順鉑耐藥進行篩查，以指導臨床用藥做出調(diào)整。

2、傳統(tǒng)的對肺癌的診斷需借助支氣管鏡活檢、痰找腫瘤細胞、胸水找腫瘤細胞、肺穿刺活檢、胸腔鏡肺活檢、縱隔或淺表淋巴結(jié)活檢、胸片(x線檢查)等手段，這些檢查方式對病人的損害較強，經(jīng)濟成本較高。

3、mirnas是一類內(nèi)源性的不編碼蛋白的微小rnas，長度一般為18-24個核苷酸，可通過與目標mrna的互補序列相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平對基因的表達進行調(diào)控，導致目標mrna的降解或者基因沉默。mirnas在腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、遷移和侵襲，及腫瘤細胞對藥物治療的應答中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

4、發(fā)明人張義彬先前研究發(fā)現(xiàn)，mir-4725-5p在肺癌患者血漿及細胞系中高表達，并可能通過調(diào)控靶基因cdh1的表達，從而促進肺癌細胞的增殖、遷移及對順鉑治療的耐藥性(張義彬.mir-4725-5p靶向抑制cdh1調(diào)控肺癌增殖、遷移和順鉑耐藥的機制研究[d].湖北中醫(yī)藥大學,2022.doi:10.27134/d.cnki.ghbzc.2022.000128.)。

5、上述先前研究初步探討了mir-4725-5p在肺癌細胞中作用的分子機制，發(fā)現(xiàn)cdh1是mir-4725-5p的潛在靶基因，mir-4725-5p在cdh1的3’utr區(qū)域有兩個結(jié)合位點。e-cadherin在高侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞中缺失或顯著下調(diào)，過表達mir-4725-5p能顯著下調(diào)e-cadherin的蛋白表達水平，這可能是mir-4725-5p促進肺癌細胞遷移和順鉑耐藥的分子機制之一。然而，e-cadherin也受到pi3k、mapk等信號通路的調(diào)控，mir-4725-5p在肺癌細胞中是否通過直接靶向cdh1調(diào)控e-cadherin的蛋白表達還需要進一步用報道基因?qū)嶒瀬眚炞C。也就是說，該研究雖然初步報道了mir-4725-5p在肺癌細胞中作用的分子機制，但其在預測肺癌增值、轉(zhuǎn)移或順鉑耐藥中存在不全面的隱患，沒有進一步驗證是否存在其他的機制，如其他的mirna同樣影響肺癌增值、轉(zhuǎn)移或順鉑耐藥，即單一標志物檢測有可能出現(xiàn)假陽性。此外，上述文獻也沒有報道m(xù)ir-4725-5p所對應的特異性引物。

6、因此，臨床上急需尋找到經(jīng)濟效益大、穩(wěn)定性高的順鉑耐藥診斷標志物，并設計出相應的特異性引物，開發(fā)出診斷試劑盒，用于順鉑耐藥診斷，以在臨床上能夠在早期、快速的判斷出患者可能會出現(xiàn)藥物耐受的情況，從而對臨床用藥做出指導與調(diào)整，避免發(fā)生耐藥而耽誤患者的最佳治療窗口。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本技術(shù)提出一種mirna在制備用于肺癌耐藥診斷產(chǎn)品中的用途。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、第一方面，本技術(shù)提供一種mirna的檢測試劑在制備用于肺癌耐藥診斷產(chǎn)品中的用途，其特征在于，所述mirna選自mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718中的至少一種。

4、本發(fā)明中可采用現(xiàn)有mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的檢測試劑用于肺癌耐藥診斷，也可采用自主設計的引物組所制備的檢測試劑用于肺癌耐藥診斷，以能夠?qū)崿F(xiàn)mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的相對表達量的定量檢測為前提。

5、作為優(yōu)選方案，所述mirna選自mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718中的任意一種，或者選自mir-1207-5p和mir-1915-3p的組合，mir-1207-5p和mir-718的組合，mir-1915-3p和mir-718的組合，mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718的組合中的任意一組。作為優(yōu)選方案，所述mirna的檢測試劑包括用于mirna的引物組，所述引物組包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物。

6、作為進一步的優(yōu)選方案，所述引物組包括以下組中的至少一組：

7、(1)用于mir-1207-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.1～3所示；

8、(2)用于mir-1915-3p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.4～6所示；

9、(3)用于mir-718的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.7～9所示。

10、作為優(yōu)選方案，所述肺癌耐藥為鉑類藥物化療引起的肺癌耐藥。

11、作為進一步的優(yōu)選方案，所述鉑類藥物選自順鉑、卡鉑、奈達鉑、奧沙利鉑、洛鉑中的至少一種；更優(yōu)選為順鉑。

12、作為優(yōu)選方案，所述診斷產(chǎn)品包括診斷試劑盒、診斷芯片中的任一種。

13、第二方面，本技術(shù)提供一種mirna的檢測試劑在制備用于肺癌耐藥診斷產(chǎn)品中的用途，所述mirna包括mir-4725-5p，還包括mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718中的至少一種。

14、作為優(yōu)選方案，所述mirna選自mir-4725-5p和mir-1207-5p的組合，mir-4725-5p和mir-1915-3p的組合，mir-4725-5p和mir-718的組合，mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-1915-3p的組合，mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-718的組合，mir-4725-5p和mir-1915-3p、mir-718的組合，mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的組合中的任意一組。

15、作為進一步的優(yōu)選方案，所述mirna為mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的組合。

16、作為優(yōu)選方案，所述mirna的檢測試劑包括：用于mir-4725-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.10～12所示；

17、以及以下組中的至少一組：

18、(1)用于mir-1207-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.1～3所示；

19、(2)用于mir-1915-3p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.4～6所示；

20、(3)用于mir-718的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.7～9所示。

21、作為進一步的優(yōu)選方案，所述mirna的檢測試劑包括：用于mir-4725-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.10～12所示；

22、用于mir-1207-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.1～3所示；

23、用于mir-1915-3p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.4～6所示；

24、用于mir-718的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.7～9所示。

25、第三方面，本技術(shù)提供一種引物組合，其特征在于，包括以下組中的至少一組：

26、(1)用于擴增mir-1207-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.1～3所示；

27、(2)用于擴增mir-1915-3p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.4～6所示；

28、(3)用于擴增mir-718的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.7～9所示；

29、(4)用于擴增mir-4725-5p的莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.10～12所示。

30、第四方面，本技術(shù)提供一種mirna的檢測試劑，其特征在于，包括權(quán)利要求9所述的引物組合。

31、作為優(yōu)選方案，所述檢測試劑還包括逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dna聚合酶和dntp。

32、第五方面，本技術(shù)提供一種基于前述的mirna的檢測試劑的檢測方法，包括以下步驟：提取樣本的rna，進行逆轉(zhuǎn)錄反應將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，再將cdna進行實時熒光定量pcr，即得mirna的相對表達量。

33、作為優(yōu)選方案，所述樣本包括血漿樣本、細胞樣本中的任一種。

34、第六方面，本技術(shù)提供一種肺癌耐藥診斷試劑盒，包括前述的mirna的檢測試劑。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

36、1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718與肺癌化療耐藥密切相關(guān)，其在耐藥肺癌患者和不耐藥肺癌患者的表達水平呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，且進一步通過細胞實驗驗證了mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718在肺癌順鉑耐藥的細胞a549/ddp和肺癌不耐藥的細胞a549中的表達水平也呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.0001)。

37、2)本發(fā)明以mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718和mir-4725-5p作為聯(lián)合檢測指標通過roc曲線得到的auc為0.910，靈敏度為82.32％，特異度為90.1％，由此證明了采用mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718作為聯(lián)合檢測指標用于診斷肺癌患者耐藥敏感性及在順鉑治療過程中進行監(jiān)測的可行性，以指導臨床的用藥。且血漿的檢查相對支氣管鏡活檢等方法對病人的損害小，經(jīng)濟效益大。

38、3)本發(fā)明還對a549/ddp和a549細胞進行了細胞耐藥實驗，發(fā)現(xiàn)過表達mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718能改變a549/ddp細胞和a549細胞對順鉑的敏感程度。