背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、已知4'-乙炔基-2'-脫氧核苷類似物具有抗hiv、aids和相關(guān)疾病的活性。

2、

3、4'-乙炔基核苷類似物的一個(gè)實(shí)例是4'-乙炔基-2-氟-2'-脫氧腺苷(efda，也稱為mk-8591)，它是一種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶易位抑制劑，在體外(kawamoto,a.,kodama,e.,sarafianos?s.f.等人,int.j.biochem.cell?biol.；40(11)：2410-20[2008]；ohrui,h.,kohgo,s.,hayakawa,h.等人,nucleosides,nucleotides&nucleic?acids,26,1543-1546[2007])和體內(nèi)(hattori,s.,ide,k.,nakata,h.等人antimicrobial.agents?andchemotherapy,53,3887-3893[2009])阻斷hiv-1和siv病毒復(fù)制。efda在美國(guó)專利號(hào)7,339,053中要求保護(hù)(在'053專利中稱為2'-脫氧-4'-c-乙炔基-2-氟腺苷)。efda具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：

4、

5、efda在細(xì)胞中代謝為其活性三磷酸合成代謝物，該合成代謝物抑制hiv逆轉(zhuǎn)錄酶。與目前可用于治療hiv感染的缺少3'-oh基團(tuán)來(lái)阻止進(jìn)入核苷酸的摻入的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nsrtis)和核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(ntrtis)相比，efda保留了3'oh基團(tuán)并通過(guò)防止引物：模板在逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)活性位點(diǎn)易位和防止進(jìn)入脫氧核糖核苷酸三磷酸(dntp)結(jié)合來(lái)作為鏈終止劑。另外，據(jù)信通過(guò)將3'-oh置于載體中，efda的修飾的核糖環(huán)的褶皺有助于抑制逆轉(zhuǎn)錄酶，其中來(lái)自進(jìn)入核苷酸的磷酸轉(zhuǎn)移無(wú)效。(michailidis?e,等人,mechanismofinhibition?ofhiv-1reverse?transcriptase?by?4'-ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine?triphosphate,j?biol?chem?284:35681–35691[2009]；michailidis?e,等人,4'-ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine(efda)inhibits?hiv-1reversetranscriptase?with?multiple?mechanisms,j?biol?chem?289:24533–24548[2014])。

6、在體外hiv復(fù)制試驗(yàn)中，efda是有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且針對(duì)已評(píng)估的所有亞型的臨床分離株均表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目共《净钚?。在體外，它在淋巴來(lái)源的細(xì)胞系和外周血單核細(xì)胞中均迅速合成代謝為活性三磷酸，并且efda三磷酸(efda-tp)的細(xì)胞內(nèi)半衰期超過(guò)72hrs。(stoddart,c.a.,galkina,等人,oral?administration?of?the?nucleoside?efda(4'-ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine)provides?rapid?suppression?of?hivviremia?in?humanized?mice?and?favorable?pharmacokinetic?properties?in?miceand?the?rhesus?macaque,antimicrob?agents?chemother,2015jul；59(7)：4190–4198,2015年5月4日線上公布)。

7、已顯示efda在hiv感染的動(dòng)物模型中具有功效，包括人源化的小鼠模型和siv感染的恒河猴模型。在小鼠和恒河猴中口服施用efda的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明吸收迅速且血漿濃度高。藥物施用后24hr，從恒河猴分離的外周血單核細(xì)胞難于感染siv的事實(shí)證明了長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)半衰期。(同上)

8、先前的包括efda在內(nèi)的4'-乙炔基核苷類似物的合成在乙炔基-脫氧核糖糖和2-氟腺嘌呤(也稱為2-氟-9h-嘌呤-6-胺)核堿基之間的c-n鍵形成中具有適度的立體選擇性。先前的合成還需要保護(hù)基進(jìn)行糖基化反應(yīng)，這降低了合成效率。

9、kei?fukuyama,等人,synthesis?ofefda?via?a?diastereoselective?aldolreaction?of?a?protected?3-keto?furanose,organic?letters?2015,17(4),pp.828-831；doi:10.1021/ol5036535)中描述的合成是從d-葡萄糖二丙酮化物的14步合成，其使用非對(duì)映選擇性反應(yīng)設(shè)定三個(gè)立體中心。異頭中心的立體化學(xué)通過(guò)具有2'-乙酰氧基引導(dǎo)基團(tuán)來(lái)控制，隨后通過(guò)水解和脫氧將其除去。該途徑需要4次色譜純化，并且化學(xué)計(jì)量地使用有毒的有機(jī)錫試劑進(jìn)行后期脫氧。

10、在另一種途徑(參見(jiàn)mark?mclaughlin,等人,enantioselective?synthesisof4'-ethynyl-2-fluoro-2'-deoxyadenosine(efda)via?enzymatic?desymmetrization,organic?letters?2017,19(4),pp.926-929)中，完全取代的4'-甲醇通過(guò)酶促不對(duì)稱化立體選擇性生成。通過(guò)催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)移氫化設(shè)定3'-立體中心，并使用底物控制以適度的立體選擇性建立異頭1'-鍵，并通過(guò)中間體的結(jié)晶實(shí)現(xiàn)立體化學(xué)純度的提高。該過(guò)程需要15個(gè)步驟，需要使用若干保護(hù)基，并以低的立體選擇性(1.8:1)在核堿基和糖片段之間產(chǎn)生糖基鍵。

11、由r-甘油醛丙酮化物制備efda的12步合成描述于kageyama,m.,等人,concisesynthesis?of?the?anti-hiv?nucleoside?efda,biosci.biotechnol.biochem,2012,76,pp.1219-1225；和enantioselective?total?synthesis?ofthe?potent?anti-hivnucleoside?efda,masayuki?kageyama,等人,organic?letters?2011?13(19),pp.5264-5266[doi:10.1021/ol202116k]中。合成使用手性原料以中等非對(duì)映立體選擇性設(shè)定3'-立體中心。色譜分離立體異構(gòu)體后，新的立體中心用于引導(dǎo)非對(duì)映選擇性炔烴添加，以設(shè)定完全取代的4'-立體中心。在幾乎沒(méi)有立體控制的情況下建立異頭1'-位，并需要色譜法來(lái)分離端基異構(gòu)體。該途徑需要在兩個(gè)不同階段進(jìn)行非對(duì)映異構(gòu)體的色譜分離，并從昂貴的手性原料開(kāi)始。

12、kohgo,s.,等人,design,efficient?synthesis,and?anti-hiv?activity?of4'-c-cyano-and4'-c-ethynyl-2'-deoxy?purine?nucleosides,nucleosides,nucleotidesand?nucleic?acids,2004,23,pp.671–690[doi:10.1081/ncn-120037508]描述了一種從現(xiàn)有核苷開(kāi)始并修飾糖和核堿基部分的合成途徑。這是一個(gè)從2-氨基-2'-脫氧腺苷開(kāi)始的18步合成，總收率低，為2.5％。

13、已知諸如嘌呤核苷磷酸化酶(pnp，ec?2.4.2.1)的酶可以高立體選擇性且不使用保護(hù)基在核苷和核苷類似物中形成糖基鍵。參見(jiàn)例如綜述：new?trends?innucleosidebiotechnology,mikhailopulo,i.a.,miroshnikov,a.i,.acta?naturae?2010,2,pp.36-58。然而，目前能夠進(jìn)行通過(guò)pnp催化的反應(yīng)的糖片段的范圍限于天然核糖和脫氧核糖的α-1-磷酸(phosphate)以及在c2'和c3'位置處具有小h、nh2或f取代基和c5'oh基團(tuán)替代的少量類似物。尚無(wú)使用環(huán)上具有碳取代基或c4'位置有任何取代的糖通過(guò)pnp催化成功進(jìn)行糖基化的報(bào)道。

14、已通過(guò)用酶磷酸戊糖變位酶(ppm，ec?5.4.2.7)將磷酸基團(tuán)從5'-羥基移位到1'-羥基位證明了pnp催化糖基化可利用核糖和脫氧核糖α-1-磷酸底物(參見(jiàn)mikhailopulo,i.a.等人，同上)。然而，ppm能夠催化該反應(yīng)的糖的范圍限于核糖、阿拉伯糖、2-脫氧核糖和2,3-二脫氧核糖。沒(méi)有報(bào)道用含有任何其他取代基的糖磷酸成功反應(yīng)的實(shí)例。

15、已知脫氧核糖磷酸醛縮酶(dera，ec?4.1.2.4)酶催化乙醛醛醇加成到其他短鏈醛上(參見(jiàn)綜述：stephen?m.dean,等人,recent?advances?in?aldolase-catalyzedasymmetric?synthesis,adv.synth.catal.2007,349,pp.1308–1320；doi:10.1002/adsc.200700115)。然而，沒(méi)有報(bào)道帶有完全取代的碳α的醛向所述醛的實(shí)例。

16、美國(guó)專利7,229,797描述了通過(guò)使用嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)并且另外使用諸如蔗糖磷酸化酶的酶以除去無(wú)機(jī)磷酸鹽副產(chǎn)物并驅(qū)動(dòng)平衡來(lái)從天然的未取代的脫氧核糖1-磷酸形成脫氧核糖核苷。它沒(méi)有公開(kāi)用于產(chǎn)生可以從非天然的4-乙炔基-d-2-脫氧核糖1-磷酸生成核苷的pnp酶的酶工程化，也沒(méi)有公開(kāi)通過(guò)ppm和dera酶的工程化作用于非天然底物，可以生成4-乙炔基-d-2-脫氧核糖1-磷酸。

17、鑒于迄今為止開(kāi)發(fā)的用于生產(chǎn)4'-乙炔基核苷類似物的困難而漫長(zhǎng)的合成選擇，期望開(kāi)發(fā)用于4'-乙炔基核苷類似物如efda的改善的酶促合成，其減少過(guò)程步驟的數(shù)量，最小化使用保護(hù)基，改善糖基化的立體選擇性，并避免使用有毒物質(zhì)。

18、令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，ppm酶具有對(duì)核糖4'位上3-原子乙炔基取代基的一些活性，并且可以通過(guò)將突變引入酶中來(lái)改善ppm酶的活性以成功開(kāi)發(fā)用于ppm催化的4-乙炔基-d-2-脫氧核糖5-磷酸(6)向4-乙炔基-d-2-脫氧核糖1-磷酸(6.5)異構(gòu)化的反應(yīng)，使生產(chǎn)4'-乙炔基-2'-脫氧核苷的更有效方法成為可能。

19、此外，還發(fā)現(xiàn)pnp酶具有對(duì)脫氧核糖4位上3原子乙炔基取代基的一些活性，并且可以通過(guò)將突變引入酶中來(lái)改善pnp酶的活性以成功開(kāi)發(fā)pnp催化的糖基化反應(yīng)，使生產(chǎn)4'-乙炔基-2'-脫氧核苷的更有效方法成為可能。

20、對(duì)整個(gè)合成方法的甚至進(jìn)一步改善來(lái)自以下發(fā)現(xiàn)：dera酶，特別是來(lái)自哈里法克斯希瓦氏菌(shewanellahalifaxensis)的dera對(duì)與具有完全取代的α-碳的2-乙炔基-甘油醛3-磷酸的醛醇縮合反應(yīng)具有活性。該發(fā)現(xiàn)允許有效合成4-乙炔基-d-2-脫氧核糖5-磷酸，它是例如包括efda的4'-乙炔基-2'-脫氧核苷類似物的前體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本發(fā)明涉及工程化酶在4'-乙炔基-2'-脫氧核苷類似物(包括efda)的新型酶促合成中的用途，與現(xiàn)有方法相比，其排除了中間體上保護(hù)基的使用，改善了糖基化的立體選擇性并大大減少了制備所述化合物所需的過(guò)程步驟的數(shù)量，以及其他過(guò)程改善。本發(fā)明進(jìn)一步涉及新型中間體，其是酶促過(guò)程的組成部分。

2、整個(gè)過(guò)程總結(jié)在以下方案1和方案2中；后一種方案提供了制備化合物5的替代方法：

3、方案1

4、

5、方案1a

6、

7、磷酸中間體的酸形式或鹽可以用于本文所述的過(guò)程中，并且不限于本文中的過(guò)程步驟的示例中提供的特定酸或鹽形式。對(duì)于本文所述的所有磷酸中間體，2x+表示兩個(gè)質(zhì)子、一個(gè)質(zhì)子與一個(gè)其他一價(jià)陽(yáng)離子、兩個(gè)一價(jià)陽(yáng)離子(相同或不同)或一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子的任何組合。本文中用-ho3po-繪制的磷酸中間體同樣可以具有與磷酸基團(tuán)締合的兩個(gè)質(zhì)子、一個(gè)質(zhì)子與一個(gè)其他一價(jià)陽(yáng)離子、兩個(gè)一價(jià)陽(yáng)離子(相同或不同)或一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子的任何組合。實(shí)例包括但不限于鈣、鎂或鋅的鹽；單或二鈉鹽，單或二鉀鹽，單或二鋰鹽；單或二銨鹽；與伯、仲或叔胺的一價(jià)或二價(jià)鹽。

8、如本領(lǐng)域很好理解的，在本文合成步驟中本文顯示或命名為醛或水合物的中間體化合物可以本文所述反應(yīng)中的形式或這種形式的混合物存在。例如，化合物(4)和(5)在方案1中分別描繪為水合物和醛，但在它們各自存在的反應(yīng)步驟中，它們各自可以以水合物或醛的形式或其混合物存在。在本文的過(guò)程步驟中，通過(guò)引用化合物編號(hào)(4)或(5)涵蓋每種這樣的形式：

9、

10、化合物(3)是非手性的，并且在本文中可以顯示為以下中的任一種：

11、

12、在其存在的反應(yīng)步驟中，化合物(6)可以以其環(huán)形式或作為開(kāi)鏈醛或水合物存在(各自作為酸或其鹽)：

13、