本發(fā)明涉及植物學(xué)和基因工程，特別涉及調(diào)控植物種子粒形和紋枯病抗性的mirna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禾本科植物中，水稻、小麥、玉米、高粱等是人類最常見(jiàn)和最主要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物。水稻是我國(guó)和世界主要糧食作物。隨著人民生活水平的提高和稻米市場(chǎng)的開(kāi)放，我國(guó)水稻大米的產(chǎn)量問(wèn)題顯得日益突出。稻米的產(chǎn)量與粒形緊密關(guān)聯(lián)，粒形的改變會(huì)影響到稻米的產(chǎn)量。因此，對(duì)水稻粒形的研究和產(chǎn)量研究往往密不可分。

2、紋枯?。╯heath?blight）是一種世界性病害，由立枯絲核菌（rhizoctonia?solanikühn）引起。該病菌寄主范圍廣，致病力強(qiáng)，目前已是我國(guó)的第一大病害，嚴(yán)重影響水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。因此，發(fā)掘抗紋枯病基因，選育和栽培抗病品種是水稻紋枯病最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的防治策略，也是資源節(jié)約型和環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迫切需求。

3、microrna（mirna）是一類廣泛存在于植物內(nèi)，大小約20-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子rna。它們能夠結(jié)合靶基因mrna的互補(bǔ)序列，通過(guò)剪切降解靶基因mrna或抑制其翻譯，來(lái)調(diào)控靶基因mrna的表達(dá)水平，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)植物各種生物功能的調(diào)控，譬如調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)病蟲(chóng)害的抗性等。

4、mirna靶標(biāo)模擬（target?mimicry）技術(shù)，是利用擬南芥中的一個(gè)基因ips1并對(duì)其基因中mirna的結(jié)合區(qū)域序列進(jìn)行改造，從而將其中與mir399互補(bǔ)序列的那個(gè)片段替換成目的基因的互補(bǔ)序列片段，構(gòu)建相應(yīng)的mimic突變體材料，實(shí)現(xiàn)沉默相應(yīng)mirna的目的。crispr/cas9技術(shù)是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其工作原理是：crrna（crispr-derived?rna）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrrna（trans-activating?rna）結(jié)合形成tracrrna/crrna復(fù)合物；該復(fù)合物引導(dǎo)cas9蛋白在與crrna配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈dna。因此，研究人員通過(guò)人工設(shè)計(jì)crrna和tracrrna這兩種rna，改造形成具有引導(dǎo)作用的sgrna（single?guiderna），以引導(dǎo)cas9對(duì)dna的定點(diǎn)切割，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

5、目前針對(duì)禾本科植物的轉(zhuǎn)基因植物培育技術(shù)雖然較多，但尚未有發(fā)現(xiàn)針對(duì)禾本科植物的種子粒形和紋枯病抗性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物種子粒形和紋枯病抗性的mir5513及其應(yīng)用，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控植物中mir5513或其前體的表達(dá)，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)植物性狀（例如種子粒長(zhǎng)、粒寬、產(chǎn)量、紋枯病抗性等）的調(diào)控。具體通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

2、本發(fā)明的第一方面，提供了一種調(diào)控植物性狀的核酸分子，選自mir5513的核苷酸序列，或其前體核苷酸序列；所述mir5513的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述mir5513的前體的序列如seq?id?no.2所示；

3、所述植物性狀為：種子的粒長(zhǎng)；和/或，種子的粒寬；和/或，植物的產(chǎn)量；和/或，植物的紋枯病抗性。

4、本發(fā)明的第二方面，提供了調(diào)控mir5513或其前體表達(dá)的方法在調(diào)控植物性狀中的應(yīng)用，通過(guò)下調(diào)/敲除mir5513或其前體的表達(dá)，促進(jìn)種子的粒長(zhǎng)增加；和/或，促進(jìn)種子的粒寬增加；和/或，提高植物的產(chǎn)量；和/或，提高植物的紋枯病抗性；

5、所述mir5513序列如seq?id?no.1所示，所述mir5513的前體的序列如seq?id?no.2所示。

6、本發(fā)明的第三方面，提供了一種調(diào)控mir5513或其前體表達(dá)的方法在選育性狀改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，通過(guò)下調(diào)/敲除mir5513表達(dá)的方法，或者下調(diào)/敲除mir5513的前體表達(dá)的方法，選育出符合種子的粒長(zhǎng)增加，和/或，種子的粒寬增加，和/或植物的產(chǎn)量增加，和/或紋枯病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物；

7、所述mir5513序列如seq?id?no.1所示，所述mir5513的前體的序列如seq?id?no.2所示。

8、本發(fā)明第四方面，提供了一種調(diào)控植物性狀的方法，通過(guò)下調(diào)或敲除植物中mir5513或其前體的表達(dá)，促進(jìn)種子的粒長(zhǎng)增加，和/或，促進(jìn)種子的粒寬增加，和/或，提高植物的種子產(chǎn)量，和/或，提高植物的紋枯病抗性；

9、所述mir5513序列如seq?id?no.1所示，所述mir5513前體序列如seq?id?no.2所示。

10、進(jìn)一步地，下調(diào)植物中mir5513或其前體表達(dá)的方法包括：通過(guò)構(gòu)建并利用mir5513沉默體，下調(diào)mir5513或其前體的表達(dá)。

11、更進(jìn)一步地，下調(diào)植物中mir5513或其前體表達(dá)的方法包括：將mimicry?mir5513序列置于ips1基因中得到ips-mim5513片段序列；將所述ips-mim5513片段序列轉(zhuǎn)入植物中，獲得轉(zhuǎn)基因植物。

12、進(jìn)一步地，敲除植物中mir5513或其前體序列的方法包括：基于crispr/cas9技術(shù)，構(gòu)建mir5513的正義鏈和反義鏈的sgrna表達(dá)盒，敲除mir5513或其前體序列。

13、本發(fā)明的第五方面，提供了一種mir5513或其前體的應(yīng)用，用于作為鑒定植物粒形和紋枯病抗性的分子標(biāo)記；種子粒形包括種子的粒長(zhǎng)和/或粒寬；所述mir5513的序列如seqid?no.1所示，mir5513的前體的序列如seq?id?no.2所示。

14、本發(fā)明的第六方面，提供了一種mir5513或其前體的下調(diào)劑的應(yīng)用，用于改良植物性狀，改良植物性狀包括：促進(jìn)種子的粒長(zhǎng)增加，和/或，促進(jìn)種子的粒寬增加，和或，提高植物的種子產(chǎn)量，和/或，提高植物的紋枯病抗性；

15、所述mir5513的序列如seq?id?no.1所示，mir5513的前體的序列如seq?id?no.2所示；所述的下調(diào)劑是特異性下調(diào)mir5513或其前體表達(dá)的干擾分子，或是基于targetmimicry技術(shù)的mir5513沉默體。

16、本發(fā)明的第七方面，提供了一種生物材料，所述生物材料含有ips-mim5513的序列片段，所述ips-mim5513的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；所述生物材料用于轉(zhuǎn)入植物中調(diào)控植物性狀，所述植物性狀為：種子的粒長(zhǎng)；和/或，種子的粒寬；和/或，植物的產(chǎn)量；和/或，植物的紋枯病抗性。

17、進(jìn)一步地，所述生物材料為表達(dá)盒、載體或宿主細(xì)胞。

18、本發(fā)明的第八方面，提供了mir5513或其前體在植物性狀改變的種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用，其特征在于，所述mir5513序列如seq?id?no.1所示，所述mir5513的前體的序列如seq?id?no.2所示；植物性狀改變?yōu)椋悍N子的粒長(zhǎng)增加，和/或，種子的粒寬增加，和/或植物的產(chǎn)量增加，和/或紋枯病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。

19、本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控mir5513或其前體的表達(dá)，能夠相應(yīng)地調(diào)控改變禾本科植物種子粒形和紋枯病抗性。具體地，通過(guò)下調(diào)/敲除mir5513或其前體的表達(dá)，能夠使種子的粒長(zhǎng)增加，種子的粒寬增加，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)禾本科植物的種子增產(chǎn)；還能夠提升禾本科植物的紋枯病抗性。目前尚未有人發(fā)現(xiàn)mir5513或其前體的表達(dá)，與禾本科植物種子粒形和紋枯病抗性是否有關(guān)聯(lián)。

20、為了下調(diào)/敲除mir5513或其前體的表達(dá)，本發(fā)明采用了兩種技術(shù)手段，即targetmimicry（模擬靶序列）技術(shù)和crispr/cas9技術(shù)。target?mimicry是通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)的mimic突變體材料，實(shí)現(xiàn)mir5513沉默。crispr/cas9技術(shù)是利用cas9蛋白與crrna配對(duì)的序列靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)mir5513剪切敲除。

21、本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉的是，下調(diào)/敲除mir5513或其前體的表達(dá)的技術(shù)包括但不限于上述target?mimicry（模擬靶序列）技術(shù)和crispr/cas9技術(shù)。除此以外，還可以通過(guò)其他在基因工程領(lǐng)域常用的基因編輯手段實(shí)現(xiàn)相同目的。

22、基于相同的技術(shù)思路，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知曉的是，在培育種子粒形改良或紋枯病抗性更好的轉(zhuǎn)基因禾本科植物時(shí)，其主要的基因編輯操作步驟也可以采用上述方法進(jìn)行。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提供了一種能夠調(diào)控發(fā)現(xiàn)了禾本科植物種子粒形和紋枯病抗性的mir5513或其前體，通過(guò)下調(diào)/敲除mir5513或其前體的表達(dá)，能夠促進(jìn)種子的粒長(zhǎng)增加，促進(jìn)種子的粒寬增加，進(jìn)而提高禾本科植物的種子產(chǎn)量；還能提高禾本科植物的紋枯病抗性，基于上述發(fā)現(xiàn)能夠運(yùn)用基因工程技術(shù)調(diào)控禾本科植物的種子粒形和紋枯病抗性，在禾本科植物的科研和栽培等方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。