本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種重組大腸桿菌及利用葡萄糖合成鯊肌醇的方法。

背景技術(shù)：

1、鯊肌醇是一種環(huán)己烷，肌醇的九種同分異構(gòu)體之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)鯊肌醇對(duì)阿爾茲海默癥有治療效果，并應(yīng)用于化妝品及健康品行業(yè)，現(xiàn)正在廣泛開(kāi)展應(yīng)用于行為和精神疾病、蛋白聚集性疾病、抗癌藥物組合物等臨床試驗(yàn)，未來(lái)鯊肌醇將是一種有潛力的一款產(chǎn)品。

2、鯊肌醇廣泛分布在植物和哺乳動(dòng)物中，但含量較少，提取純度和成本將是一個(gè)難點(diǎn)，化學(xué)合成面臨著對(duì)環(huán)境的挑戰(zhàn)，而目前生物轉(zhuǎn)化法是從肌肉肌醇轉(zhuǎn)化成鯊肌醇，轉(zhuǎn)化率不高，同時(shí)肌肉肌醇和鯊肌醇是同分異構(gòu)體，給下游分離造成困難，而實(shí)驗(yàn)室采用硼酸提取鯊肌醇方法，工業(yè)上不允許，所以我們使用與目的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)差異較大的葡萄糖為底物生產(chǎn)鯊肌醇打通工業(yè)化的壁壘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種重組大腸桿菌，對(duì)鯊肌醇的轉(zhuǎn)化率高。

2、為解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌為突變型大腸桿菌r04導(dǎo)入肌醇-3-磷酸合成酶基因(ips)、肌醇單磷酸酶基因(imp)、肌醇脫氫酶基因(idh)和鯊肌醇脫氫酶基因(sid)制得；

4、所述idh的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述idh的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，所述sid的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述sid的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

5、所述突變型大腸桿菌r04為突變型大腸桿菌sg104敲掉內(nèi)源葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因后所得。

6、肌醇脫氫酶基因(idh)序列：來(lái)源于geo.thermodenitrificans，人工合成序列(由南京金斯瑞生物科技公司合成)，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示：

7、atggcgctga?ccgtgggtgt?tatcggtgtg?ggccgtattg?gcaagctgca?cgttgacaac

8、ctgcgtctga?tcccgcaagt?gcgtgttaaa?agcgtgagcg?acgtggttat?taaccacctg

9、gatagctggg?cgaaggaaaa?acaagttgag?gtgctgacca?gcgactaccg?tgatatcctg

10、aacgacccgg?aaatcgatgc?ggtgtttatt?tgcagcccga?ccaacaccca?cgcgaccatc

11、attaaggaag?cggcggttgc?gggcaagcac?atcttctgcg?agaaaccggt?gagcttcacc

12、gttgaggaaa?ccaaagaggc?gctggaagtg?gttgagaaga?cccaggtgaa?actgcaagtt

13、ggcttcaacc?gtcgttttga?tccgaacttc?cgtaagatcc?gtgaactggt?gcagaacggc

14、accattggcg?agccgcacat?cctgcgtatt?accagccgtg?acccggagcc?gccgagcatc

15、gattatatta?aaagcagcgg?tggcctgttt?atggacatga?tgatccacga?cttcgatatg

16、gcgcgttaca?ttatgggtag?cgaagtggtt?gaggtttctg?cgtatggcgc?ggtgctggtt

17、gatccggcga?tcggtgaagc?gggcgacatt?gataccgcgg?tggttaccct?gaagtttgcg

18、aacggtgcgc?tgggcgtgat?cgacaacagc?cgtcaggcgg?tttacggtta?tgatcaacgt

19、ctggaagtgt?tcggtagcaa?gggtgcggcg?cgtgcggaca?acaaccgtcc?gaccaacgtg

20、gaagttagca?ccgcggagca?cgttctgaag?gataaaccgc?tgtacttctt?tctggaacgt

21、tacacccaag?cgtatatcca?cgaagtggcg?gagtttgtta?aggcgatcct?gcacaacgag

22、ccggtgattt?gcagcggttt?cgacggcctg?caagcgcaac?gtatcgcgga?agcggcgaag

23、aaaagcctgg?agaccggtgt?gccggttaaa?ctggaggaag?ttaacccggc?ggcggcgatc

24、taa

25、肌醇脫氫酶基因(idh)的氨基酸序列如seq?id?no.2所示：

26、matvgvgvgr?gkhvdnrvrv?ksvsdvvnhd?swakkvvtsd?yrdnddavcs?tnthatkaav

27、agkhckvstv?tkavvktvkv?gnrrdnrkrv?ngtghrtsrd?sdykssggmd?mmhddmarym

28、gsvvvsayga?vvdagagddt?avvtkangag?vdnsravygy?drvgskgaar?adnnrtnvvs

29、tahvkdkyry?tayhvavkah?nvcsgdgara?aakkstgvvk?vnaaa

30、鯊肌醇脫氫酶基因(sid)序列：來(lái)源于p.thermoglucosidasius，人工合成序列(由南京金斯瑞生物科技公司合成)，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示：

31、atggcggtgc?gttgcgcggt?tctgggtctg?ggccgtctgg?gttaccacca?cgcgaagaac

32、ctggcgaccc?accagatcag?cggtgcgcaa?ctggtgagcg?tggttgaccc?gatggagggt

33、cgtgcggaac?agttcgcgcg?tgactttggc?atcgagcact?ggaccgaaca?cccggatgag

34、gttttcgaag?acccgcgtat?tgatgcggtg?atcattgtta?ccccgaccag?cacccacgcg

35、gatatgatcc?agcgtgcggc?gcgtaacggc?aaggcgattt?ttgtggagaa?accgctgacc

36、caaagcctgg?aggaagcgga?cgaaatcatt?aagaccatca?aacagtacaa?cgtgatttgc

37、caagttggct?tcatgcgtcg?ttttgatccg?gcgtatgcgg?aggcgaagcg?tcgtatcgaa

38、gcgggtgaca?tcggcaagcc?gatttatttc?aaaggtatta?cccgtgatgc?gggcagcccg

39、ccggcggagt?tcattaaaca?cagcggtcgt?gtgtttctgg?acgttagcat?ccacgactac

40、gatattgcgc?gttatctgat?gggtgcggaa?atcaccagcg?tgagcgcgca?cggccgtgtt

41、ctgctgcacc?cgttcatgga?ggaatttcag?gacctggatc?aagcgattac?ctacgtgcac

42、ttcgacagcg?gtgcggcggg?tgatattgag?gcgagccgta?acagcccgta?tggtcacgat

43、attcgtaccg?agatcattgg?caccgaaggc?agcctgttta?tcggcaccct?gcgtaaccag

44、aacgttaccc?tgctgaacag?caaaggcagc?acctacgaaa?tcattccgga?cttccaaacc

45、cgttttaacg?atgcgtatcg?tctggagctg?gtgcacttca?tcgaatgcgt?tcagaacaac

46、caaatcccga?aggtgaccga?gattgacggc?aaggttaacc?tgaaaatcgc?gattgcggcg

47、accgagagct?tcgatagcgg?caagatggtt?cacattaaac?gtgagcacct?ggagaagagc

48、tactaa

49、鯊肌醇脫氫酶基因(sid)的氨基酸序列如seq?id?no.4所示：

50、mavrcavggrgyhhaknathsgavsvvdmgraardghwth?dvdrdavvtt?sthadmraar

51、ngkavktsad?ktkynvcvgm?rrdayaakrr?agdgkykgtr?dagsakhsgr?vdvshdydar

52、ymgatsvsah?grvhmddaty?vhdsgaagda?srnsyghdrt?gtgsgtrnnv?tnskgstydt

53、rndayrvhcv?nnkvtdgkvn?kaaatsdsgk?mvhkrhksy

54、肌醇-3-磷酸合成酶基因(ips)、肌醇單磷酸酶基因(imp)記載于已公開(kāi)的中國(guó)專利cn113667686a中，由中國(guó)科學(xué)院北京微生物研究所陶勇組惠贈(zèng)。

55、突變型大腸桿菌r04菌株是由突變型大腸桿菌sg104菌株敲除了內(nèi)源葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(pgi)而來(lái)，由中國(guó)科學(xué)院北京微生物研究所陶勇組惠贈(zèng)。突變型大腸桿菌sg104記載于已公開(kāi)的中國(guó)專利cn110734887a中，是利用crispr技術(shù)(jiang?y,chen?b,duan?c,sun?b,yang?j,yang?s:multigene?editing?in?the?escherichia?coli?genomevia?the?crispr-cas9?system.appl?environ?microbiol?2015,81:2506-2514.)將大腸桿菌bw25113的d-葡萄糖pts通透酶基因(ptsg)替換為葡糖激酶基因(glk)，且將丙酮酸氧化酶基因(poxb)替換為乙酰輔酶a合成酶基因(acs)，且將半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)子基因(galr)替換為運(yùn)動(dòng)單胞菌來(lái)源的d-乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(zglf)后得到的大腸桿菌突變體，其基因型為bw25113δptsg::glkδgalr::zglfδpoxb::acs。突變型大腸桿菌r04基因型為bw25113δptsg::glkδgalr::zglfδpoxb::acsδpgi。

56、本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種重組大腸桿菌的制備方法，底物和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)差異大，得到的重組大腸桿菌對(duì)鯊肌醇的轉(zhuǎn)化率高。

57、為解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

58、一種重組大腸桿菌的制備方法，包括以下步驟：

59、s1.pcr引物

60、

61、s2.雙酶切體系及反應(yīng)條件

62、對(duì)質(zhì)粒pyb1s進(jìn)行xhoi/spei雙酶切：10*buffer?5μl，bsa?2μl，xhoi/spei2/2μl，dna?20μl，ddh2o?19μl，共50μl，37℃酶切1h，回收目的載體片段約3500bp；

63、s3.目的基因片段(idh)獲得

64、2×高保真酶mix?50μl，模板1μl，f1?2μl，r1?2μl，ddh2o補(bǔ)齊100μl，反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2min；98℃變性20s，降溫至退火溫度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫，其后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；

65、目的基因片段(sid)獲得

66、2×高保真酶mix?50μl，模板1μl，f2?2μl，r2?2μl，ddh2o補(bǔ)齊100μl，反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2min；98℃變性20s，降溫至退火溫度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫，其后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；

67、目的基因片段(ips)獲得

68、2×高保真酶mix?50μl，模板1μl，f3?2μl，r3?2μl，ddh2o補(bǔ)齊100μl，反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2min；98℃變性20s，降溫至退火溫度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫，其后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；

69、目的基因片段(imp)獲得

70、2×高保真酶mix?50μl，模板1μl，f4?2μl，r4?2μl，ddh2o補(bǔ)齊100μl，反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2min；98℃變性20s，降溫至退火溫度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫，其后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；

71、s4.目的基因片段(ips+imp)獲得

72、2×高保真酶mix50μl，模板1μl，f3?2μl，r5?2μl，ddh2o補(bǔ)齊100μl，反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2min；98℃變性20s，降溫至退火溫度55℃退火20s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫，其后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；

73、目的基因片段(idh+sid)獲得

74、2×高保真酶mix50μl，模板1μl，f5?2μl，r2?2μl，ddh2o補(bǔ)齊100μl，反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2min；98℃變性20s，降溫至退火溫度55℃退火20s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫，其后進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化；

75、s5.gibson酶連體系及反應(yīng)條件

76、gibson?buffer?6μl，目的載體片段1μg，目的基因片段(ips+imp、idh+sid)各1.5μl，ddh2o補(bǔ)齊10μl，50℃連接1h；

77、s6.轉(zhuǎn)化

78、酶連后取10μl加入dh5α感受態(tài)，冰浴30min，42℃水浴熱激90s，冰上靜置5min；加入600μl?lb液體培養(yǎng)基，涂布于lb(str100μg/ml)平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16h，可見(jiàn)相應(yīng)菌落；

79、s7.陽(yáng)性克隆子篩選

80、菌落pcr驗(yàn)證后，提質(zhì)粒送華大基因測(cè)序驗(yàn)證；

81、s8.表達(dá)菌株獲得

82、對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到突變型大腸桿菌r04感受態(tài)，轉(zhuǎn)化成功的菌株即為重組大腸桿菌。

83、本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用葡萄糖合成鯊肌醇的方法，單一菌株轉(zhuǎn)化步驟少，鯊肌醇的轉(zhuǎn)化率高。

84、為解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

85、一種利用葡萄糖合成d-手性肌醇的方法，取重組大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，然后加入葡萄糖進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，得d-手性肌醇。

86、優(yōu)選的，高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基組成為：一水檸檬酸2g/l，磷酸二氫鉀14g/l，三水磷酸氫二鉀4.5g/l，硫酸銨4g/l，葡萄糖20g/l，甘油5g/l，硫酸鎂0.6g/l，酵母粉1g/l，微量元素10ml/l,補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖600g/l，硫酸鎂2g/l，酵母粉10g/l。

87、優(yōu)選的，高密度發(fā)酵的控制條件：接種量2％，發(fā)酵罐的罐壓0.02mpa，起始轉(zhuǎn)速300rpm，ph?7.0，37℃培養(yǎng)，od600到30降溫至30℃，od600升至70時(shí)加入2g/l阿拉伯糖誘導(dǎo)，起始風(fēng)量為2.5l/min,轉(zhuǎn)速400rpm時(shí)調(diào)3l/min，轉(zhuǎn)速500rpm時(shí)調(diào)3.5l/min，轉(zhuǎn)速600rpm時(shí)調(diào)4l/min，溶氧起始100，溶氧反彈開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，使do保持25％。

88、優(yōu)選的，開(kāi)始補(bǔ)料～2h內(nèi)補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入量為28-30g/h，2h～4h內(nèi)補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入量為33-35g/h，4h～誘導(dǎo)前補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入量為38-40g/h，誘導(dǎo)后補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入量為33-35g/h。

89、優(yōu)選的，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化中轉(zhuǎn)化體系為40od600，pbs?50mm，ph?7.0，溫度37℃，200rpm。

90、優(yōu)選的，葡萄糖進(jìn)行分批加入轉(zhuǎn)化體系，每次加入100mm葡萄糖，每5h加入一次，共計(jì)加入500mm，轉(zhuǎn)化30h結(jié)束。

91、由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

92、1.本發(fā)明的重組大腸桿菌可以直接對(duì)葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖全細(xì)胞合成鯊肌醇的新路徑，整個(gè)合成工藝只有一株菌，優(yōu)化好發(fā)酵培養(yǎng)基后實(shí)現(xiàn)多酶表達(dá)，易于工業(yè)化放大。

93、2.原料葡萄糖和產(chǎn)品鯊肌醇的結(jié)構(gòu)差異化，易于下游分離，能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，且大大提高了鯊肌醇的純度。

94、3.本發(fā)明在鯊肌醇的轉(zhuǎn)化過(guò)程中步驟少，轉(zhuǎn)化率高，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化易分離，菌體可以重復(fù)使用，極大的節(jié)約了成本。

95、4.原料葡萄糖的成本低，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

96、5.本發(fā)對(duì)重組大腸桿菌的高密度中碳源進(jìn)行了優(yōu)化，采用甘油加葡萄糖的方式，發(fā)酵后生物量od600值更高，對(duì)鯊肌醇的轉(zhuǎn)化率更高。