本發(fā)明涉及作物分子育種，具體涉及一種茄子雄性不育基因smopr3在創(chuàng)制茄子核雄性不育株系中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前在生產(chǎn)上可利用的作物雄性不育作物不育體系主要有三類，一類是細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cms)，目前廣泛應(yīng)用于水稻、油菜等作物的雜交育種中，但其存在恢復(fù)系選育困難、轉(zhuǎn)育繁瑣，育種周期相對(duì)較長；細(xì)胞質(zhì)單一，且易受溫度影響，育性的不穩(wěn)定性導(dǎo)致可育和不育的轉(zhuǎn)變等諸多問題。第二類為細(xì)胞核雄性不育(nms)。配制組合自由，容易出現(xiàn)強(qiáng)優(yōu)勢組合，特別是隱性核不育，許多材料都可以作為其恢復(fù)系，并且不受細(xì)胞質(zhì)的影響，可解決三系中雄性不育細(xì)胞質(zhì)單一化的問題。但制種時(shí)需要去掉50％可育株。第三類為基因工程雄性不育，一般育性敗育徹底，制種純度高，轉(zhuǎn)育相對(duì)容易(ling?et?al.,2007)。細(xì)胞工程雄性不育最具有代表性的為利用ta29-barnase等基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因作物。但目前該方法受到專利以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的限制，尚沒有大范圍應(yīng)用。

2、茄子(solanum?lycopersicum；2n＝2x＝24)屬于茄科(solanaceae)茄子屬植物，是世界上普遍栽培的極其重要的蔬菜作物之一，同時(shí)也是生殖發(fā)育研究的模式植物。目前植物雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑,雜種優(yōu)勢利用作為作物育種的主要方向和目標(biāo),在生產(chǎn)上取得了很大地成功。雜種優(yōu)勢也廣泛應(yīng)用于茄子中，但目前普遍采用自交系雜交方法，雄性不育系在茄子雜交制種中應(yīng)用較少。所以發(fā)掘茄子雄性不育調(diào)控基因并創(chuàng)建新型可利用的雄性不育系一直是茄子品種選育的重要課題。

3、茉莉酸(ja)是植物體內(nèi)廣泛存在的一種植物激素,由亞麻酸經(jīng)十八烷碳烯酸代謝途徑合成的，它不僅作為內(nèi)源生長物質(zhì),在植物的整個(gè)發(fā)育進(jìn)程中起調(diào)節(jié)作用。茉莉酸對(duì)植物后期花藥發(fā)育也有重要調(diào)控作用，其通過調(diào)控花絲伸長、花藥開裂而影響育性。ja生物合成基因lox的突變抑制花絲伸長、延緩花藥開裂，從而導(dǎo)致花粉不育(caldelari?et?al.,2011)。其它ja合成基因和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的突變也可影響花絲伸長、花藥開裂過程(huang?et?al.,2017)。12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxo-phytodienoic?acidreductase,opr)是茉莉酸生物合成即十八烷碳烯酸代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,在過氧化物酶體中將12-氧代植物二烯酸(opda)還原為12-氧代植物烯酸(opc-8:0)。在植物基因組中,opr屬于oye家族,是黃素單核苷酸依賴的氧化還原酶,并且主要存在三種亞型：opr1、opr2和opr3(schaller?et?al.,2000)。目前,盡管對(duì)擬南芥及水稻等模式植物中少數(shù)幾個(gè)opr基因的生化功能和遺傳作用進(jìn)行了深入解析,但是對(duì)于整個(gè)植物opr基因家族的進(jìn)化及生物學(xué)功能并不清楚，尤其對(duì)于其在茄子等蔬菜作物生殖發(fā)育過程的生物學(xué)功能并沒有涉及。進(jìn)化分析表明，茄子基因組中有3個(gè)opr家族基因，其中smopr1同擬南芥atopr1與atopr2同源性較高，而smopr3同擬南芥atopr3較接近，但smopr2同擬南芥的opr酶親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)，這反映出opr家族基因存在物種特異性，所以基因家族各成員在茄子生長發(fā)育過程尤其是雄性器官發(fā)育中的生物學(xué)功能值得深入探究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有茄子雄性不育系匱乏、難于商業(yè)化利用的技術(shù)難題，在克隆鑒定一種茄子育性調(diào)控新基因基礎(chǔ)上，提供一種茄子雄性不育基因smopr3在創(chuàng)制茄子核雄性不育株系中的應(yīng)用，鑒定了一個(gè)新的茄子核雄性不育調(diào)控關(guān)鍵基因smopr3，可用于創(chuàng)制不同類型茄子雄性不育系，用于雜交育種可降低人工成本，提高雜種純度。

2、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種茄子雄性不育基因smopr3在創(chuàng)制茄子核雄性不育株系中的應(yīng)用，所述的雄性不育基因smopr3編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步地，定點(diǎn)敲除smopr3基因或抑制smopr3基因的表達(dá)，使得茄子中編碼seqid?no.2所示氨基酸序列發(fā)生缺失、變異或抑制，通過敲除獲得的純合突變體smopr3營養(yǎng)生長與野生型相似，但花粉發(fā)生敗育，不能正常結(jié)果或只形成少量無籽果實(shí)，進(jìn)而獲得茄子的雄性不育株系。

5、優(yōu)選地，采用基于crispr/cas9系統(tǒng)或者基因工程方法定點(diǎn)敲除smopr3基因或抑制smopr3基因的表達(dá)。

6、優(yōu)選地，所述基于crispr/cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除smopr3基因的方法，具體包括如下步驟：

7、a)合成單核苷酸序列引物sgrna序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示；

8、sgsmopr3-1(seq?id?no.3):5'-aaacgtgggagagattgaatttgc-3'

9、sgsmopr3-2(seq?id?no.4):5'-gattgcaaattcaatctctcccac-3'

10、b)先將合成的sgrna1/2序列及其對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列通過退火形成雙鏈，將形成的雙鏈sgrna1/2連接到atu6-26?sk載體上；

11、c)將u6-26-sgrna1/2-smopr3連接到酶切后的35s-cas9?sk載體上；

12、d)將構(gòu)建好的基因敲除載體u6-26-sgrna1/2-smopr3-35s-cas9?sk連接到最終轉(zhuǎn)化載體pcambia1301載體上；

13、e)利用農(nóng)桿菌侵染法將pcambia1301-u6-26-sgrna1/2-smopr3-35s-cas9載體轉(zhuǎn)入茄子品種“杭州紅茄”中，提取t0代轉(zhuǎn)基因植株基因組dna，使用載體通用引物如seqidno.5和seq?id?no.6所示的序列檢測轉(zhuǎn)基因植株t-dna插入情況，挑選有t-dna插入的轉(zhuǎn)基因植株；

14、tdna-f(seq?id?no.5):5'-tgaccagaagcgacaagaa-3'

15、tdna-r(seq?id?no.6)：5'-cttatcgctgttcctcttgg-3'

16、f)利用如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的特異性引物擴(kuò)增基因組片段并進(jìn)行測序，篩選突變植株純合敲除類型。

17、smopr3-f1(seq?id?no.7):5'-tgtaaaacgacggccagt-3'

18、smopr3-r1(seq?id?no.8):5'-cgtgggagagattgaatt-3'

19、第二方面，本發(fā)明提供一種上述的應(yīng)用創(chuàng)制得到的茄子核雄性不育株系。

20、第三方面，本發(fā)明還提供一種所述茄子核雄性不育系在雜交品種選育中的應(yīng)用，以所述茄子核雄性不育系為母本，以另一個(gè)茄子優(yōu)良自交系為父本，配制雜種。

21、與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的有益效果如下：

22、本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化手段，獲得茄子基因smopr3定向敲除純合突變體，與野生型相比smopr3突變體花粉敗育并且雄性不育性可穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明鑒定了一個(gè)新的調(diào)控茄子雄蕊發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，為人工創(chuàng)建核不育系提供了新途徑。

23、該方法利用分子生物學(xué)方法克隆一個(gè)茄子花粉發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因smopr3，利用crispr/cas9敲除該基因獲得純合的突變體株系，可創(chuàng)建穩(wěn)定的核不育株系。smopr3基因突變的茄子植株花粉敗育，不能發(fā)育形成正常果實(shí)，或只能形成少量單性結(jié)實(shí)的果實(shí)；利用野生型花粉授粉突變體柱頭，其子房可正常發(fā)育成果實(shí)，并含有能夠正常萌發(fā)的種子，表明雌蕊發(fā)育正常；通過測交方法可以保存該不育系，該不育株系可作為母本用于雜交種配制。