本發(fā)明屬于生物制藥，尤其涉及一種(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf及其用于制備芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體的方法。

背景技術(shù)：

1、芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性化合物是一種廣泛存在于藥物分子如甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考、屈西多巴、維貝隆，以及一些天然活性產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中的基本骨架，其結(jié)構(gòu)式如下1-8所示：

2、

3、本發(fā)明中的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性化合物是合成上述結(jié)構(gòu)類似藥物的關(guān)鍵中間體，目前傳統(tǒng)工業(yè)上主要采用羥醛縮合，硼氫化鈉還原，l-(+)-酒石酸拆分來生產(chǎn)2s,3r構(gòu)型的芳香族α-氨基-β-羥基酯類藥物中間體，整體路線存在如下缺點(diǎn)：1)羥醛縮合催化劑硫酸銅的后處理問題；2)酒石酸拆分收率低，理論上最大只有50％(de1938513；us3927054；us5382673)。此外，除了傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)方法，目前也報(bào)道了通過動(dòng)態(tài)還原動(dòng)力學(xué)拆分合成這類化合物及其結(jié)構(gòu)類似物的化學(xué)方法，但這些化學(xué)方法常需要使用過渡金屬釕或銠，嚴(yán)重污染環(huán)境而且底物加載量也不高(guodong?sun，zihongzhou,zhonghualuo,etal.organic?letter,2017,19,4339-4342；guodong?sun，weilin?jian,zhonghua?luo,etal.organic?process?research&development,2019,23,1204-1212)，因此嚴(yán)重限制了其在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。

4、采用羰基還原酶動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)還原生產(chǎn)芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性化合物往往能克服上述化學(xué)路線的一些不足，且理論收率能達(dá)100％，突破傳統(tǒng)拆分50％的限制。例如在2013年，默克公司就報(bào)道了通過羰基還原酶cdx-018催化還原化合物2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸甲酯，選擇性地生成得到(2s,3r)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-羥基-3-苯基丙酸甲酯(維貝隆藥物中間體)，ee值大于99％，dr值大于99：1，收率為92％(fengxu,john?y.l.chung,jefferyc.moore,etal.organicletter,2013,15,1342-1345)；此外，陳少欣團(tuán)隊(duì)報(bào)道了采用(2s,3r)-羰基還原酶kred-02及其突變體m30催化6種不同結(jié)構(gòu)的α-氨基-β-氧代酯類底物來生產(chǎn)α-氨基-β-羥基酯類手性化合物，這些化合物可以合成氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考等藥物，其轉(zhuǎn)化率達(dá)98％，產(chǎn)物手性ee值>99％,手性de值>99％(cn?109207531a；cn112176007a；jiezou，guoweini，jiaweitang，etal.europeanjournaloforganic?chemistry,2018,5044-5053；jiawei?tang,liuqingchen,luwen?zhang,et?al,catalysis?science&technology,2021,11,6755-6769)；陳芬兒院士團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了采用羰基還原酶kred-bt催化一系列芳香族α-氨基-β-氧代酯類化合物來生產(chǎn)芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性藥物中間體，反應(yīng)收率高，立體選擇性優(yōu)異(cn113249417a；qing-chunzhang,zuo-linlu,chenhu,etal.asianjournaloforganicchemistry,2021,10,1-5)。最近，我們團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了利用羰基還原酶easdr6突變體easdr6a138l/s193a催化2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸甲酯，選擇性地生成產(chǎn)物(2s,3r)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-羥基-3-苯基丙酸甲酯(維貝隆藥物中間體),底物加載量達(dá)到200g/l，底物轉(zhuǎn)化率大于99％，產(chǎn)物ee值大于99％，de值大于99％(xiaojian?zhang,feiyang,kailichen,etal.bioorganic?chemistry,2023,140,106788)。

5、因此通過羰基還原酶動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)還原來制備芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性藥物中間體具有底物加載量高，產(chǎn)物收率高，產(chǎn)物立體選擇性高，操作簡單，綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，非常適合推進(jìn)到工業(yè)化生產(chǎn)。

6、自然界篩選到的野生型的羰基還原酶往往催化活力和選擇性都較差，用量較大，不利于實(shí)際應(yīng)用，利用蛋白質(zhì)工程改造的方法改造野生酶以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)要求是最佳的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體的制備方法，該方法涉及(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf參與的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)還原反應(yīng)，可以一步構(gòu)筑雙手性中心，合成路線簡單環(huán)保，產(chǎn)物收率和立體選擇性高。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf，由seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)下列突變所得：(1)第190位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸；(2)第193位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔?3)第201位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

4、由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本發(fā)明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90％以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的，所述改變包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，谷氨酰胺替換天冬酰胺，酶變體也可具有非保守性改變。

5、本發(fā)明還提供所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因。

6、進(jìn)一步地，本發(fā)明中(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

7、由于核苷酸序列的特殊性，任何本發(fā)明所示多核苷酸的變體，只要其與前述多核苷酸具有90％以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以是生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。

8、本發(fā)明還涉及含有所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因的重組載體，以及利用所述重組載體構(gòu)建的含有所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的重組基因工程菌。

9、所述重組載體包含適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)的控制序列可操作地連接的多核苷酸。

10、優(yōu)選重組載體的表達(dá)載體為pet-28a(+)。

11、重組基因工程菌構(gòu)建方法通常為：將(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因同表達(dá)載體pet-28a(+)連接，構(gòu)建了含有(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因的異源表達(dá)重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌中，獲得含有重組質(zhì)粒的重組基因工程菌。所述重組基因工程菌的宿主菌通常為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)。

12、所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf可按以下方法獲得：

13、構(gòu)建含有所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf編碼基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌中，對獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的菌體細(xì)胞，破碎后獲得(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的粗酶液，粗酶液純化即可獲得(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf純酶。

14、本發(fā)明還提供采用(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf在生物催化式x所示的芳香族α-氨基-β-氧代酯類化合物底物，不對稱還原反應(yīng)制得式y(tǒng)所示的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體的應(yīng)用。

15、本發(fā)明還一種提供芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體的制備方法，所述方法為：

16、式x所示的芳香族α-氨基-β-氧代酯類化合物為底物，(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf為催化劑，葡萄糖為輔底物，nadp+為輔酶，葡萄糖脫氫酶gdh6構(gòu)建輔酶循環(huán)的催化劑，進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)，制得式y(tǒng)所示的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體；

17、所述方法的反應(yīng)式如下式所示：

18、

19、式x或式y(tǒng)中，r1為c6～c10的芳香基或c4～c10的雜環(huán)芳基，所述c6～c10的芳香基或c4～c10的雜環(huán)芳基上的h不被取代或被一個(gè)以上的取代基a取代，

20、所述c6～c10的芳香基優(yōu)選苯基或萘基；

21、所述c4～c10的雜環(huán)芳基優(yōu)選噻吩、呋喃或苯并二氧六環(huán)；

22、所述取代基a為甲砜基、硝基、鹵素、甲氧基中的一種或多種；

23、式x或式y(tǒng)中，r2為叔丁氧羰基(boc)或二氯乙?；?/p>

24、在本發(fā)明中，所述的(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf和葡萄糖脫氫酶gdh6可以以各種形式來使用。例如，可使用表達(dá)本發(fā)明所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf和葡萄糖脫氫酶gdh6的靜息細(xì)胞或濕菌體，也可以使用粗酶液、純酶或者粗酶粉等各種不同形式，或者使用固定化酶。

25、優(yōu)選地，為獲得較高的轉(zhuǎn)化效率和降低成本，優(yōu)選使用粗酶液。

26、具體的，優(yōu)選所述方法為：

27、以含所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體超聲破碎后的粗酶液為催化劑，以式x所示的芳香族α-氨基-β-氧代酯類化合物為底物，葡萄糖為輔底物，葡萄糖脫氫酶gdh6的粗酶液為構(gòu)建輔酶循環(huán)的催化劑，dmso為助溶劑，nadp+為輔酶，在ph值為6-8的緩沖溶液中構(gòu)成反應(yīng)體系，制得式y(tǒng)所示的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體。

28、葡萄糖脫氫酶gdh6的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

29、反應(yīng)的溫度優(yōu)選為30～40℃、攪拌速度優(yōu)選600～1000rpm。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選10～15小時(shí)。

30、更進(jìn)一步，緩沖溶液優(yōu)選100mm、ph?7.0的磷酸鉀緩沖溶液，整個(gè)反應(yīng)過程中用6mnaoh溶液控制反應(yīng)ph在7.0左右。

31、所述催化劑可以為酶的形式或者菌體的形式。所述酶的形式包括游離酶、固定化酶，包括純化酶、粗酶、發(fā)酵液、載體固定的酶、細(xì)胞破碎物等：所述菌體的形式包括存活菌體細(xì)胞和/或死亡菌體細(xì)胞。

32、所述催化劑為粗酶液的形式時(shí)，所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf粗酶液的濃度以其濕菌體重量計(jì)為15～20g/l緩沖溶液，所述葡萄糖脫氫酶gdh6粗酶液的濃度以其濕菌體重量計(jì)為5～10g/l緩沖溶液，所述底物濃度為10～50g/l，所述輔底物葡萄糖的濃度與底物濃度相同，所述助溶劑dmso的體積用量為反應(yīng)體系體積的10～20％，所述輔酶nadp+的濃度0.5～5g/l，優(yōu)選0.75g/l。

33、所述濕菌體可按如下方法制備：將含有所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的編碼基因的重組基因工程菌或含有葡萄糖脫氫酶gdh6的編碼基因的重組基因工程菌接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm下培養(yǎng)8h獲得種子液，再以體積濃度2％接種量接種至新鮮的含有終濃度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm下培養(yǎng)至菌體od600達(dá)0.6～0.8，加入終濃度為0.1mm的iptg，28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4℃、8000rpm離心10min，棄去上清液，分別收集獲得(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的濕菌體和葡萄糖脫氫酶gdh6的濕菌體。

34、本發(fā)明所述(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的純酶可按如下方法進(jìn)行制備：將(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf的濕菌體用生理鹽水清洗,將收集的濕菌體用100mm、ph?7.0的磷酸鉀緩沖液重懸成50g/l的菌體溶液，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎,獲得細(xì)胞破碎液；將細(xì)胞破碎液離心，所得到的上清即為所需的粗酶液；粗酶液可進(jìn)一步用鎳柱純化、透析脫鹽后得到純酶。

35、超聲條件為：45％功率，持續(xù)2s，間歇4s，連續(xù)破碎20min。

36、所述反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液分離純化，制得式y(tǒng)所示的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體；反應(yīng)液分離純化的方法通常為：反應(yīng)液用甲基叔丁基醚萃取，合并有機(jī)層、干燥，過濾，濾液蒸除溶劑，制得式y(tǒng)所示的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

38、本發(fā)明構(gòu)建了含(2s,3r)選擇性的羰基還原酶突變體vaf和含葡萄糖脫氫酶gdh6的工程菌應(yīng)用于催化還原式x所示的芳香族α-氨基-β-氧代酯類化合物，為式y(tǒng)所示的芳香族α-氨基-β-羥基酯類手性中間體y的生產(chǎn)提供了一種新的生物制備途徑。相對于其它制備方法，使用本發(fā)明方法具有綠色安全、操作簡便、易于工業(yè)放大等優(yōu)勢，且該突變體具有高催化活性、產(chǎn)物選擇性高、底物普適性廣、高底物濃度耐受等優(yōu)點(diǎn)，可以合成多種藥物的關(guān)鍵中間體(如氯霉素、屈西多巴、維貝隆等)，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用前景。