本發(fā)明涉及微生物?，尤其涉及一種重組鹽單胞菌及其在重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鹽單胞菌（ halomonas）是一類嗜鹽菌，其能夠耐受高鹽和高ph條件進(jìn)行生長，營養(yǎng)需求較低，且對(duì)惡劣環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)。鹽單胞菌具有較強(qiáng)的抗污染性和魯棒性，因此不易在發(fā)酵過程中染菌，可進(jìn)行開放式連續(xù)發(fā)酵，作為工業(yè)生產(chǎn)底盤菌具有明顯優(yōu)勢(shì)，有利于降低大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的成本，提高發(fā)酵生產(chǎn)效率。然而，目前利用鹽單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量較低，仍需進(jìn)一步提高鹽單胞菌的重組蛋白產(chǎn)量，以更好地適用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種重組鹽單胞菌及其在重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2、微生物合成蛋白質(zhì)需要消耗大量能量，而微生物細(xì)胞的鞭毛不僅在合成過程中消耗大量能量，合成完成后參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)同樣會(huì)消耗大量能量。因此，對(duì)鞭毛合成相關(guān)基因（簡(jiǎn)稱鞭毛基因）進(jìn)行敲除，理論上可以減少細(xì)胞在鞭毛合成和鞭毛運(yùn)動(dòng)方面的能量消耗，節(jié)約細(xì)胞能量。然而，本發(fā)明在研發(fā)過程中嘗試敲除鹽單胞菌的鞭毛基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于鞭毛對(duì)于鹽單胞菌而言在鹽單胞菌培養(yǎng)所需高鹽堿的高滲透壓環(huán)境中對(duì)環(huán)境化學(xué)因子感受和運(yùn)動(dòng)起到比常規(guī)細(xì)菌更為重要的作用，敲除鞭毛基因?qū)甑纳L造成極大的負(fù)面影響，即鞭毛基因?yàn)辂}單胞菌在高滲透壓條件下的關(guān)鍵基因，重組蛋白的產(chǎn)量非但沒有提升，反而大幅下降。經(jīng)不斷嘗試，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過對(duì)鹽單胞菌的鞭毛基因進(jìn)行誘導(dǎo)敲低，不僅能夠保證菌株生長，而且其表達(dá)重組蛋白的水平顯著提高，重組蛋白的產(chǎn)量顯著提升。

3、具體地，本發(fā)明提供以下所述的技術(shù)方案。

4、第一方面，本發(fā)明提供一種重組鹽單胞菌，所述重組鹽單胞菌表達(dá)重組蛋白，且其鞭毛基因被敲低；其中，所述敲低為誘導(dǎo)敲低；所述重組鹽單胞菌的重組蛋白產(chǎn)量因鞭毛基因被誘導(dǎo)敲低而提高。

5、本發(fā)明中，誘導(dǎo)敲低是指通過誘導(dǎo)進(jìn)行敲低，可采用常用的誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)結(jié)合基因敲低技術(shù)實(shí)現(xiàn)，例如：利用誘導(dǎo)型crispri系統(tǒng)進(jìn)行鞭毛基因的敲低。

6、優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)敲低為在重組蛋白合成期進(jìn)行誘導(dǎo)敲低。

7、在進(jìn)行重組蛋白發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，鹽單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)周期可分為菌體生長期和重組蛋白合成期，兩個(gè)時(shí)期的界限可根據(jù)細(xì)胞比生長速率判斷，具體對(duì)應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間可能會(huì)因?yàn)槌跏冀臃N量以及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等不同。優(yōu)選地，所述重組蛋白合成期為細(xì)胞比生長速率μ<0.01的階段。

8、優(yōu)選地，在菌體生長期不進(jìn)行crispri系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)，在重組蛋白合成期進(jìn)行crispri系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)。

9、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在菌體生長期不進(jìn)行crispri系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)更有利于菌株的生長，以達(dá)到較高的細(xì)胞量，在重組蛋白合成期通過誘導(dǎo)crispri系統(tǒng)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)鞭毛基因的抑制作用，能夠顯著提高重組蛋白的產(chǎn)量。

10、優(yōu)選地，所述重組鹽單胞菌中包含誘導(dǎo)型crispri系統(tǒng)，用于誘導(dǎo)敲低所述鞭毛基因。

11、上述誘導(dǎo)型crispri系統(tǒng)包含sgrna表達(dá)盒以及dcas9表達(dá)盒；其中，所述sgrna表達(dá)盒包含靶向所述鞭毛基因的sgrna以及位于其上游的自誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所述自誘導(dǎo)啟動(dòng)子受鹽單胞菌中pha的累積誘導(dǎo)。

12、上述受鹽單胞菌中pha的累積誘導(dǎo)是指所述啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度受pha的合成調(diào)控，即隨著pha的累積該啟動(dòng)子的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。

13、對(duì)于受鹽單胞菌中pha的累積誘導(dǎo)的自誘導(dǎo)啟動(dòng)子可采用專利申請(qǐng)cn113999869a中公開的啟動(dòng)子。所述的自誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含phar的結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選為啟動(dòng)子phap1、phap2、phap3或porin-r，這些啟動(dòng)子的序列分別如專利申請(qǐng)cn113999869a的seq?id?no.1、2、3、6所示。

14、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，使用上述受pha累積誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可使得鞭毛基因在菌體生長階段仍表達(dá)，能夠較好地保證重組鹽單胞菌的生長，隨著生長期結(jié)束、pha的逐漸累積，鞭毛基因的表達(dá)水平降低，有利于促進(jìn)重組蛋白的合成，可以顯著提高重組蛋白的產(chǎn)量，與其他誘導(dǎo)啟動(dòng)子相比，在促進(jìn)重組蛋白產(chǎn)量提升方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

15、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，所述自誘導(dǎo)啟動(dòng)子為phap1，其序列如seq?idno.2所示。與其他自誘導(dǎo)啟動(dòng)子相比，啟動(dòng)子phap1促進(jìn)重組蛋白產(chǎn)量提升的效果更優(yōu)。

16、以上所述的dcas9表達(dá)盒包含dcas9基因以及位于其上游的啟動(dòng)子。

17、用于表達(dá)dcas9基因的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子。優(yōu)選為porin58啟動(dòng)子。

18、以上所述的sgrna表達(dá)盒和dcas9表達(dá)盒可位于同一個(gè)質(zhì)粒上，或者分別位于不同的質(zhì)粒上。所述質(zhì)粒為鹽單胞菌的表達(dá)質(zhì)粒。

19、本發(fā)明中，所述鞭毛基因包括選自flhd、flgb、flgc、flgg、flgh、flir、fliq、flip、flim、flil?中的一種或多種。

20、優(yōu)選地，所述鞭毛基因?yàn)閒lhd。

21、優(yōu)選地，所述flhd編碼蛋白的氨基酸序列為如seq?id?no.1所示的序列編碼的氨基酸序列。

22、所述flhd基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

23、對(duì)于flhd基因，所述sgrna的序列如seq?id?no.3所示。

24、本發(fā)明中，所述重組蛋白為選自水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶中的一種或多種。

25、優(yōu)選地，所述重組蛋白為選自淀粉酶、纖維素酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、木糖苷酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、內(nèi)切葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、脫氧核糖核酸酶、過氧化氫酶中的一種或多種。

26、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，所述重組蛋白為淀粉酶。

27、優(yōu)選地，所述淀粉酶為來源于地衣芽孢桿菌（ bacillus?licheniformis）的α-淀粉酶。

28、優(yōu)選地，所述重組鹽單胞菌還包含所述重組蛋白的編碼基因、所述重組蛋白的表達(dá)盒或者所述重組蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。

29、本發(fā)明中，所述鹽單胞菌優(yōu)選為鹽單胞菌（ halomonas?bluephagenesis）或鹽單胞菌（ halomonas?campaniensis）。

30、第二方面，本發(fā)明提供以上所述的重組鹽單胞菌的制備方法，所述方法包括向鹽單胞菌中導(dǎo)入所述誘導(dǎo)型crispri系統(tǒng)的步驟。所述鹽單胞菌能夠表達(dá)重組蛋白或者所述方法還包括向鹽單胞菌中導(dǎo)入重組蛋白的編碼基因或表達(dá)盒的步驟。

31、本發(fā)明中，表達(dá)盒是指能夠?qū)崿F(xiàn)基因表達(dá)的重組dna分子，可包含啟動(dòng)子和目的基因，或者包含啟動(dòng)子、目的基因和終止子。

32、第三方面，本發(fā)明提供以上所述的重組鹽單胞菌在重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。

33、第四方面，本發(fā)明提供一種重組蛋白的生產(chǎn)方法，所述方法包括：對(duì)以上所述的重組鹽單胞菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集培養(yǎng)物中的重組蛋白。

34、上述生產(chǎn)方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中，在菌體生長期不進(jìn)行crispri系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)，在重組蛋白合成期進(jìn)行crispri系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)。

35、利用鹽單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)勢(shì)在于，鹽單胞菌可以進(jìn)行開放式發(fā)酵而無需額外滅菌，同時(shí)，發(fā)酵過程中不需要使用各類空氣濾膜和復(fù)雜的無菌操作來減少染菌的可能性，極大地節(jié)約了生產(chǎn)成本以及人力物力。鹽單胞菌常規(guī)的開放式發(fā)酵依托于高鹽高ph的環(huán)境，以抑制其他的雜菌生長。

36、上述生產(chǎn)方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)以糖類物質(zhì)為碳源。

37、優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基中還包含5-100g/l氯化鈉（優(yōu)選為20-40g/l）；添加氯化鈉的作用主要在于提供嗜鹽菌生長所需的滲透壓環(huán)境。

38、所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為35-37℃；ph為8.5-9.0。

39、優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基包括如下組分：葡萄糖10-30g/l，氯化鈉5-30g/l，尿素0.4-0.7g/l，mgso40.1-0.3g/l，kh2po41.3-1.7g/l，以及0.03-0.07g/l?fe(iii)-nh4-citrate，0.01-0.04g/l?cacl2·2h2o，0.08-0.2mg/l?znso4·7h2o，0.02-0.04mg/l?mncl2·4h2o，0.2-0.4?mg/l?h3bo3，0.1-0.3mg/l?cocl2·6h2o，0.008-0.015?mg/l?cuso4·5h2o，0.01-0.03?mg/l?nicl2·6h2o，0.02-0.04?mg/l?namoo4·2h2o。

40、第五方面，本發(fā)明提供敲低鞭毛基因在提高鹽單胞菌的重組蛋白產(chǎn)量中的應(yīng)用，所述敲低為誘導(dǎo)敲低。

41、上述應(yīng)用中，在菌體生長期不進(jìn)行鞭毛基因的敲低，在重組蛋白合成期進(jìn)行鞭毛基因的誘導(dǎo)敲低。

42、優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)敲低通過向所述鹽單胞菌中導(dǎo)入誘導(dǎo)型crispri系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

43、上述誘導(dǎo)型crispri系統(tǒng)包含sgrna表達(dá)盒以及dcas9表達(dá)盒；其中，所述sgrna表達(dá)盒包含靶向所述鞭毛基因的sgrna以及位于其上游的自誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所述自誘導(dǎo)啟動(dòng)子受鹽單胞菌中pha的累積誘導(dǎo)。

44、優(yōu)選地，所述自誘導(dǎo)啟動(dòng)子為啟動(dòng)子phap1、phap2、phap3或porin-r。

45、優(yōu)選地，所述鞭毛基因包括選自flhd、flgb、flgc、flgg、flgh、flir、fliq、flip、flim、flil中的一種或多種。

46、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述鞭毛基因?yàn)閒lhd。所述flhd編碼蛋白的氨基酸序列為如seqid?no.1所示的序列編碼的氨基酸序列。

47、上述應(yīng)用中，所述重組蛋白優(yōu)選為淀粉酶。所述淀粉酶優(yōu)選為來源于地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶。

48、本發(fā)明中，所述淀粉酶產(chǎn)量?jī)?yōu)選為酶活產(chǎn)量。

49、本發(fā)明的有益效果至少包括：本發(fā)明通過誘導(dǎo)敲低鞭毛基因顯著提高了鹽單胞菌的重組蛋白產(chǎn)量，所提供的重組鹽單胞菌相比于出發(fā)菌株和直接敲除鞭毛基因的菌株具有明顯提高的重組蛋白產(chǎn)量，為以鹽單胞菌為底盤菌的重組蛋白生產(chǎn)菌株的選育提供了有效的改造策略和方法，對(duì)于拓展鹽單胞菌的工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域以及提高重組蛋白的生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本具有重要意義。