本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種用于提高細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化效率的基因及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)化是將質(zhì)?；蚓€性片段形式的dna轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中的過程，是細(xì)菌的分子克隆中最常用的技術(shù)，是現(xiàn)代微生物學(xué)的一項(xiàng)基礎(chǔ)性技術(shù)。由于dna分子呈負(fù)電性，與同樣攜帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜間存在靜電互斥效應(yīng)，正常情況下無法通過細(xì)胞膜，因此需要通過對(duì)細(xì)菌的處理使dna能夠通過。

2、目前在細(xì)菌中轉(zhuǎn)化dna的方法包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)移法等?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法是利用緩沖液(如氯化鈣溶液)洗滌菌體，改變細(xì)胞膜電性和通透性，制備感受態(tài)細(xì)胞使dna容易通過，但制備過程中影響因素較多，容易失敗。電轉(zhuǎn)化法是利用緩沖液洗滌菌體以改變細(xì)胞膜通透性后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電擊處理使細(xì)胞膜表面出現(xiàn)孔洞，從而讓dna進(jìn)入，但需要特殊儀器，操作不便。

3、自然轉(zhuǎn)化是弧菌屬等部分水源性細(xì)菌菌屬在天然環(huán)境下自發(fā)發(fā)生的一種轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。其原理為全局轉(zhuǎn)錄因子tfox表達(dá)后啟動(dòng)細(xì)菌鞭毛形成、外源dna解旋與結(jié)合保護(hù)等相關(guān)功能基因，使得外源dna可以通過鞭毛進(jìn)入細(xì)菌。tofx是發(fā)生這一現(xiàn)象的關(guān)鍵基因。通過外源導(dǎo)入和人工調(diào)控表達(dá)tfox，可以增強(qiáng)細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化能力并使其可控發(fā)生，從而高效地在細(xì)菌中轉(zhuǎn)化dna。

4、因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種簡單快速、低成本、高效的dna轉(zhuǎn)化方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是一種簡單快速、低成本、高效的dna轉(zhuǎn)化方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于提高細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化效率的基因，其特征在于，所述基因是根據(jù)需鈉弧菌的密碼子頻率對(duì)霍亂弧菌基因組上的tfox基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化而得到的，為vchtfox基因。

3、在本發(fā)明的較佳實(shí)施方式中，所述基因的序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明還提供前述基因的表達(dá)盒基因，在vchtfox基因前后分別添加t7啟動(dòng)子和t7終止子，即得到所述表達(dá)盒基因。

5、在本發(fā)明的較佳實(shí)施方式中，所述表達(dá)盒基因的序列如seq?id?no.2所示。

6、本發(fā)明還提供一種用于提高細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化效率的基因的應(yīng)用方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

7、步驟1、將所述vchtfox基因的表達(dá)盒連接到質(zhì)粒上，在大腸桿菌中擴(kuò)增并抽提重組質(zhì)粒，即為pet28a-vchtfox質(zhì)粒；

8、步驟2、將步驟1中的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)需鈉弧菌野生型宿主菌株vmax，即為vmax-pet28a-vchtfox細(xì)菌；

9、步驟3、培養(yǎng)步驟2中轉(zhuǎn)化后的vmax菌株，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，即成為感受態(tài)細(xì)胞；

10、步驟4、向步驟3中的感受態(tài)細(xì)胞中加入供體質(zhì)粒和誘導(dǎo)劑，進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，從而表達(dá)外源基因。

11、在本發(fā)明的佳實(shí)施方式中，所述步驟2具體包括：

12、步驟2.1、按照如下配方配制lb3培養(yǎng)基：胰蛋白胨即tryptone10?g/l，酵母提取物即yeast?extract5?g/l，氯化鈉即nacl30?g/l，在5ml培養(yǎng)基中接種100μl需鈉弧菌vmax菌株種子液，在30℃、220rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；

13、步驟2.2、在50ml?lb3培養(yǎng)基中培養(yǎng)vmax至od600＝0.4～0.6，4200rpm離心8min，去上清，用25ml蔗糖緩沖液重懸，重復(fù)3次，最終重懸于5ml蔗糖緩沖液中，所述蔗糖緩沖液配方為蔗糖232.8g/l，磷酸氫二鉀即k2hpo41.6?g/l；

14、步驟2.3、采用電穿孔儀，將pet28a-vchtfox質(zhì)粒以1.4kv/1.6kv，200ω，25μf的條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化入步驟2.2制備的菌液中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于添加了200ng/μl卡那霉素的lb3固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)過夜，所得陽性克隆即為vmax-pet28a-vchtfox細(xì)菌，所述l3固體培養(yǎng)基即在lb3培養(yǎng)基中添加18g/l的瓊脂粉。

15、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式中，所述步驟3具體包括：

16、取步驟2中轉(zhuǎn)化后的菌液，在添加了200ng/μl卡那霉素的lb3固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約8h至看到明顯的單菌落，在falcon?14ml試管中，用移液器精準(zhǔn)加入2.997ml?lb3培養(yǎng)基和3μl?1m?iptg溶液，挑取單菌落培養(yǎng)，放入30℃搖床培養(yǎng)4-4.5h，轉(zhuǎn)速220rpm，待菌液變渾濁后測量其od600，至od600＝3.9～4.6時(shí)，完成感受態(tài)細(xì)胞制備。

17、在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施方式中，所述步驟4具體包括：

18、步驟4.1、配置iom培養(yǎng)基：將購買的商用iom培養(yǎng)基固體按照28g/l的濃度溶解為液體并121℃高溫滅菌20分鐘；

19、步驟4.2、按照每個(gè)待轉(zhuǎn)化片段實(shí)驗(yàn)組＝350μl?iom培養(yǎng)基+0.35μl?1m?iptg+3.5μl感受態(tài)細(xì)胞比例制成預(yù)混體系，再吸取350μl預(yù)混體系與供體質(zhì)粒溶液混合；

20、步驟4.3、將步驟4.2的混合液30℃靜置培養(yǎng)6h以上，添加1ml?lb3培養(yǎng)基復(fù)蘇，30℃220rpm培養(yǎng)1.5h，在平板上吸取菌液，吸取的菌液為20-100μl，30或37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

21、本發(fā)明還提供另一種前述用于提高細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化效率的基因的應(yīng)用方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

22、步驟1、將所述vchtfox基因的表達(dá)盒連接到質(zhì)粒上，在大腸桿菌中擴(kuò)增并抽提重組質(zhì)粒，即為pet28a-vchtfox質(zhì)粒；

23、步驟2、將步驟1中的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)需鈉弧菌野生型宿主菌株vmax，即為vmax-pet28a-vchtfox細(xì)菌；

24、步驟3、培養(yǎng)步驟2中轉(zhuǎn)化后的vmax菌株，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，即成為感受態(tài)細(xì)胞；

25、步驟4、向步驟3中的感受態(tài)細(xì)胞中加入供體質(zhì)粒和誘導(dǎo)劑，并加入vchtfox基因的線性片段，進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，得到的插入了vchtfox基因的細(xì)菌為vcod-2；

26、步驟5、培養(yǎng)步驟4中的vcod-2細(xì)菌，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，成為vcod-2感受態(tài)細(xì)胞；

27、步驟6、向步驟5中的vcod-2感受態(tài)細(xì)胞加入供體質(zhì)粒和誘導(dǎo)劑，并加入供體dna線性片段，進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，從而表達(dá)外源基因。

28、在本發(fā)明的較佳實(shí)施方式中，所述步驟4中，vchtfox基因的插入位點(diǎn)為vmax?1號(hào)基因組上t7?rna聚合酶基因座。

29、技術(shù)效果

30、1、本發(fā)明在需鈉弧菌中導(dǎo)入全局轉(zhuǎn)錄因子tfox，用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)，實(shí)現(xiàn)可控的自然轉(zhuǎn)化，可將除需鈉弧菌以外的弧菌屬細(xì)菌以及其他水源性細(xì)菌開發(fā)為能發(fā)生自然轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，可省去電轉(zhuǎn)化、化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備的復(fù)雜工序，單次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程約48-72小時(shí)，其中手動(dòng)操作時(shí)間約為25分鐘，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到10-1～10-2之間，簡化了細(xì)菌dna轉(zhuǎn)化的操作步驟，解除了對(duì)于電轉(zhuǎn)儀、水浴鍋等儀器設(shè)備的需求；

31、2、需鈉弧菌和霍亂弧菌的親緣關(guān)系相近，霍亂弧菌的tfox基因有更強(qiáng)的啟動(dòng)自然轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)的能力，裝配在基因組上的基因隨著細(xì)胞分裂過程中的dna復(fù)制而自主分配到子代細(xì)胞中，不會(huì)發(fā)生丟失，從洗油中直接略過多步深加工，且在無需去除雜質(zhì)的情況下，甚至可利用雜質(zhì)從而代謝生成高值化合物。

32、以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。