本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，具體是一種免標記比率型黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體生物傳感器。

背景技術(shù)：

1、黃曲霉毒素b1主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，是自然界中毒性最強的真菌毒素，其主要污染玉米、小麥、花生等農(nóng)作物及其制品，造成巨大的食品安全隱患。黃曲霉毒素b1經(jīng)食物鏈進入機體后，作用于全身多個器官，主要靶點為肝臟，可能造成急性或慢性的肝損傷，甚至肝癌，具有極強的致癌、致畸、致突變性，并產(chǎn)生免疫抑制、生殖毒性等危害。黃曲霉毒素b1早在1993年就被世界衛(wèi)生組織(who)的癌癥研究機構(gòu)列為1類致癌物。因此，開發(fā)簡單、快速、高靈敏且低成本的黃曲霉毒素b1現(xiàn)場篩查方法對于保障食品安全至關(guān)重要。

2、核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(selex)篩選獲得的寡核苷酸序列，通過折疊成特定構(gòu)象與靶標分子高親和力結(jié)合，同時還具有高特異性，高穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)可裁剪性和序列可編程性等優(yōu)勢。目前，已開發(fā)出多種用于黃曲霉毒素b1檢測的適配體傳感器，包括光學(xué)、電化學(xué)和光電化學(xué)傳感平臺，這些傳感器具有高靈敏度和寬檢測范圍的優(yōu)勢。然而，常用的黃曲霉毒素b1適配體(afla.17-2-3)僅具備靶標識別能力，在適配體傳感器制備過程中，通常不可避免地需要引入額外的修飾(如熒光團或納米材料)以實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這導(dǎo)致了較高的檢測成本，并可能對適配體的折疊產(chǎn)生不利影響。

3、發(fā)光適配體是一種特殊的核酸適配體，他能夠與特定熒光分子結(jié)合，并顯著增強其熒光強度，兼具了靶標識別和信號輸出的能力，因此，發(fā)光適配體在免標記熒光傳感和生物成像領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。afla.17-10是現(xiàn)有唯一報道的黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體，然而由于其較長的序列(80nt)，較低的結(jié)合親和力，有限的熒光增強能力和不確定的結(jié)合機制，到目前為止，未有任何應(yīng)用。功能核酸裁剪技術(shù)是一種高效的適配體工程化策略，其通過截短、增長、替換、融合和劈裂的手段，實現(xiàn)適配體的結(jié)構(gòu)精簡，結(jié)合親和力提高和特定生物功能的優(yōu)化。因此，該技術(shù)在黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和性能提升方面具有較大潛力。

4、在熒光生物傳感器的構(gòu)建中，比率熒光相較于單一熒光信號具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，因此受到廣泛青睞。硫黃素t已被報道能夠與多種核酸結(jié)構(gòu)如g-四鏈體和空腔發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)合實現(xiàn)熒光增強，這使其成為開發(fā)黃曲霉毒素b1免標記比率型熒光適配體傳感器的良好候選染料分子。

5、本發(fā)明構(gòu)建了系統(tǒng)性的適配體裁剪策略，該策略通過“最小活性結(jié)構(gòu)探究”、“核心結(jié)合位點鑒定”和“多性能優(yōu)化”三個步驟對黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體進行裁剪優(yōu)化，簡化了適配體結(jié)構(gòu)，獲得了具體的靶標結(jié)合位點，提升了親和力、發(fā)光強度以及甲醇耐受性。隨后，通過引入熒光小分子硫黃素t(tht)，成功構(gòu)建了一種黃曲霉毒素b1免標記比率型發(fā)光適配體生物傳感器，實現(xiàn)了黃曲霉毒素b1快速、低成本、超靈敏的比率型熒光檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明旨在提出一種免標記比率型黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體生物傳感器。

2、為達到上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種功能增強的黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體，其特征在于，所述適配體序列為：

3、af-40：cgtgacgcccgtcgtatgtactttatacctagacgtgcgc，如seq?id?no.2所示；

4、af-15：tcgtactttatacga，如seq?id?no.7所示；

5、af-13：cgtactttatacg，如seq?id?no.8所示；

6、ba：cgtactttatacgcgtactttatacg，如seq?id?no.30所示；

7、ba3a：cgtactttatacgaaacgtactttatacg，如seq?id?no.31所示；

8、bt3a：cgtactttatacgtttcgtactttatacg，如seq?id?no.32所示；

9、bc3a：cgtactttatacgccccgtactttatacg，如seq?id?no.33所示；

10、bg3a：cgtactttatacggggcgtactttatacg，如seq?id?no.34所示。

11、另一方面，本發(fā)明提供了一種上述黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體在黃曲霉毒素b1檢測中的應(yīng)用。

12、另一方面，本發(fā)明提供了一種免標記比率型黃曲霉毒素b1發(fā)光適配體生物傳感器，其特征在于，一、免標記比率型生物傳感器的構(gòu)建策略；二、免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器序列；三、免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器條件優(yōu)化；四、黃曲霉毒素b1的檢測；

13、所述免標記比率型生物傳感器的構(gòu)建策略，為發(fā)光靶標與嵌入式小分子核酸染料進行位點競爭，雙熒光信號的比率與靶標濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，根據(jù)熒光比率值對靶標進行定量檢測；

14、所述免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器的序列為：5’-cgtactttatacgcgtactttatacg-3’，如seq?id?no.30所示。

15、所述免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器的溶液中硫黃素t熒光染料的濃度范圍為2.5～40μmol·l-1。

16、所述免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器的溶液中鎂離子濃度范圍為2.5～25mmol·l-1。

17、所述免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器的反應(yīng)時間為0～30min。

18、所述免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器對黃曲霉毒素b1的選擇性：

19、選用與黃曲霉毒素b1可能共存的真菌毒素：嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉毒素、伏馬菌素b1和t-2毒素，用免標記比率型黃曲霉毒素b1生物傳感器進行實驗，檢測黃曲霉毒素b1和硫黃素t特征波長處的熒光比率。

20、另一方面，本發(fā)明提供了一種上述生物傳感器對黃曲霉毒素b1進行定量檢測的方法，其特征在于，標準曲線的建立：

21、將25μl?40μmol·l-1硫黃素t與25μl?2μmol·l-1ba混合，其中ba序列的核苷酸序列如seq?id?no.30所示，向反應(yīng)體系中添加50μl梯度濃度的afb1溶液，分別為0.1，2.5，5，10，50，100，200，400，800ng·ml-1，混合均勻后室溫孵育3min，使用熒光分光光度計測定溶液體系在420nm和485nm處的黃曲霉毒素b1和硫黃素t熒光強度。

22、另一方面，本發(fā)明提供了一種上述生物傳感器對含有黃曲霉毒素b1的實際樣品進行檢測的方法，其特征在于，具體操作如下：

23、精確稱取5g粉碎后的待測樣品，置于50ml離心管中，以20，50，100ng·ml-1的afb1預(yù)先添加到玉米粉中，以5，10，20ng·ml-1的afb1預(yù)先添加到小麥粉中；加入20ml?70％甲醇-水溶液渦旋混勻，在室溫下超聲提取20min后，以6000rpm離心10分鐘，收集上清液并使用0.22μm濾膜過濾，檢測上清液中黃曲霉毒素b1和硫黃素t的熒光強度，熒光發(fā)射波長分別為420nm和485nm；隨后將黃曲霉毒素b1和硫黃素t的熒光比值代入標準曲線，計算得到待測樣品中黃曲霉毒素b1的含量，實現(xiàn)對黃曲霉毒素b1的定量檢測。

24、另一方面，本發(fā)明提供了一種上述適配體或上述生物傳感器或上述方法在黃曲霉毒素b1檢測方法開發(fā)、黃曲霉毒素b1食品安全或環(huán)境檢測試劑盒中的應(yīng)用。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

26、1、本發(fā)明提出了系統(tǒng)性的適配體裁剪策略，有效簡化了原始適配體的結(jié)構(gòu)，并獲得了適配體與靶標結(jié)合的核心位點，為進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和傳感構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)；

27、2、本發(fā)明基于裁剪獲得了黃曲霉毒素b1二價適配體，有效提升了其親和力、發(fā)光強度以及甲醇耐受性，促進了其在生物傳感中的實用性；

28、3、本發(fā)明提出了一種新型的afb1生物傳感策略，通過在發(fā)光適配體體系中引入tht小分子染料，基于結(jié)合位點競爭原理實現(xiàn)免標記比率型傳感檢測；

29、4、本發(fā)明提出的黃曲霉毒素b1生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)簡單、快速、低成本和超靈敏的黃曲霉毒素b1現(xiàn)場檢測，具有一定的產(chǎn)業(yè)化潛力；

30、5、本發(fā)明提出的黃曲霉毒素b1生物傳感器在0.1ng·ml-1～800ng·ml-1范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系(r2＝0.9913)，線性回歸方程為y＝-22.62x+62.29，檢出限低至0.036ng·ml-1。