本發(fā)明涉及土壤微生物修復(fù)，具體是涉及一種有機污染土壤固碳消污功能菌群的制備方法。

背景技術(shù)：

1、多環(huán)芳烴（polycyclic?aromatic?hydrocarbons，?pahs）是一類含有多個苯環(huán)的難降解有機污染物，具有遺傳毒性、突變性和致癌性。自然環(huán)境中的pahs主要來源于焦化、煉油、煤炭燃燒以及秸稈和柴火燃燒。土壤是環(huán)境中pahs的主要富集場所之一，進入土壤的pahs可被有機質(zhì)吸附，難以消除，從而導(dǎo)致土壤污染。農(nóng)田是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主體，而農(nóng)田土壤pahs污染問題會威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人群健康。因此，農(nóng)田土壤中pahs污染問題應(yīng)引起足夠重視。

2、土壤是陸地上最大的碳庫，25%的潛在全球氣候問題是由土壤碳引起。因此，土壤對于減少碳排放和增加碳匯非常重要，在減緩氣候變化方面具有可靠的生態(tài)功能。

3、如何高效處理土壤中pahs仍是亟需解決的關(guān)鍵問題。通過微生物進行生物降解可以將有害的有機污染物分解為無毒或低毒產(chǎn)物，具有安全、經(jīng)濟及應(yīng)用方便等特點。同時，土壤中的微生物在土壤有機碳的形成和保持有機碳的持久性中也起到關(guān)鍵作用。目前，已有不少國內(nèi)外專家篩選出具有pahs降解功能的菌株，但可以同時實現(xiàn)土壤中菲降解和co2固定的微生物功能菌群制備技術(shù)鮮有報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種有機污染土壤固碳消污功能菌群的制備方法，包括以下步驟：

2、s1、第一菌種培養(yǎng)：取sphingobium?sp.rs2菌種使用lb培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，得到sphingobium?sp.rs2單菌待用；

3、s2、第二菌種培養(yǎng)：取nitrososphaera?viennensis.en76菌種在恒溫培養(yǎng)箱中持續(xù)避光培養(yǎng)，得到nitrososphaera?viennensis.en76單菌待用；

4、s3、細胞數(shù)定量：使用單拷貝基因nahe對s1所制備的sphingobium?sp.rs2單菌中的細胞數(shù)進行定量，使用單拷貝基因amoa對s2所制備的nitrososphaera?viennensis.en76單菌中的細胞數(shù)進行定量；

5、s4、單菌混合：將所述sphingobium?sp.rs2單菌和所述nitrososphaeraviennensis.en76單菌按細胞數(shù)1:1的比例混合，細胞數(shù)取108，得到功能菌群。

6、進一步地，所述s1中，活化培養(yǎng)的方法為：將一接種環(huán)sphingobium?sp.rs2菌種加入到20~30mllb培養(yǎng)基中，將sphingobium?sp.rs2菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期，進行離心處理，去掉上清液，得到sphingobium?sp.rs2沉淀，向所述sphingobium?sp.rs2沉淀中加入無機鹽培養(yǎng)基進行重懸處理，重復(fù)上述離心處理和重懸處理的步驟2~3次，最后一次重懸后得到所述sphingobium?sp.rs2單菌。

7、更進一步地，所述將sphingobium?sp.rs2菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)條件為：溫度為28~32℃，在120~160rpm的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)10~15h。

8、更進一步地，所述離心處理的條件為：溫度為3~5℃，在7500~8500rpm的轉(zhuǎn)速下離心4~6min。

9、進一步地，所述s2中，恒溫培養(yǎng)箱的溫度為40~43℃，所述持續(xù)避光培養(yǎng)過程中，每次培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到所述nitrososphaera?viennensis.en76單菌。

10、進一步地，所述s3中，對s1所制備的sphingobium?sp.rs2單菌中的細胞數(shù)進行定量的方法為：

11、基于單拷貝基因nahe的基因序列設(shè)計引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如seq?id?no.1所示，反向引物的序列如seq?id?no.2所示，

12、seq?id?no.1：ttggcgtgccgatgtggtg

13、seq?id?no.2：gcgggaaatcgaatttgaagg

14、將所述引物進行pcr擴增，得到基因序列，并將所述基因序列導(dǎo)入質(zhì)粒，構(gòu)建得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，再將所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，得到模板dna，然后進行熒光定量pcr，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后使用dna提取試劑盒提取1ml?sphingobium:sp.rs2單菌的dna，進行熒光定量pcr，獲得ct值，根據(jù)ct值計算拷貝數(shù)，單拷貝基因的拷貝數(shù)代表每微升細胞數(shù)。

15、更進一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)體系如下：

16、 試劑 體積 ace?qpcr?sybr?green?master?mix 10?μl 正向引物 0.4?μl 反向引物 0.4?μl 模板dna 1?μl <![cdata[ddh₂o]]> 8.2?μl

17、所述熒光定量pcr的程序條件為：將所述模板dna在95℃下進行預(yù)變性加熱，保持5min，隨后繼續(xù)在95℃下進行變性加熱10s，退火30s，退火溫度為56℃，延伸30s，延伸溫度72℃，共完成40個循環(huán)，進行溶解曲線分析，分析條件為95℃下加熱15s，降溫至60℃加熱1min，升溫至95℃保持1s。

18、進一步地，所述s3中，對s2所制備的nitrososphaera?viennensis.en76單菌中的細胞數(shù)進行定量的方法為：

19、基于單拷貝基因amoa的基因序列設(shè)計引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如seq?id?no.3所示，反向引物的序列如seq?id?no.4所示，

20、seq?id?no.3：tcggtctcggatacttgaa

21、seq?id?no.4：gcacgctgtcatcatcat

22、將所述引物進行pcr擴增，得到基因序列，并將所述基因序列導(dǎo)入質(zhì)粒，構(gòu)建得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，再將所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，得到模板dna，然后進行熒光定量pcr，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后使用dna提取試劑盒提取1ml?nitrososphaera?viennensis.en76單菌的dna，進行熒光定量pcr，獲得ct值，根據(jù)ct值計算拷貝數(shù)，單拷貝基因的拷貝數(shù)代表每微升細胞數(shù)。

23、更進一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)體系如下：

24、 試劑 體積 ace?qpcr?sybr?green?master?mix 10?μl 正向引物 0.4?μl 反向引物 0.4?μl 模板dna 1?μl <![cdata[ddh₂o]]> 8.2?μl

25、所述熒光定量pcr的程序條件為：將所述模板dna在95℃下進行預(yù)變性加熱，保持5min，隨后繼續(xù)在95℃下進行變性加熱10s，退火30s，退火溫度為60℃，延伸30s，延伸溫度72℃，共完成40個循環(huán)，進行溶解曲線分析，分析條件為95℃下加熱15s，降溫至60℃加熱1min，升溫至95℃保持1s。

26、優(yōu)選地，還包括：通過瓊脂糖凝膠電泳驗證所設(shè)計的引物的可行性。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

28、（1）本發(fā)明的一種有機污染土壤固碳消污功能菌群的制備方法中，菌種培養(yǎng)簡單，復(fù)配難度低，易操作，不僅可以修復(fù)菲污染農(nóng)田土壤，降低其對農(nóng)產(chǎn)品安全的威脅，又可以固定co2，增加農(nóng)田土壤中soc含量。

29、（2）通過采用本發(fā)明的方法制備得到的功能菌群修復(fù)pahs污染農(nóng)田土壤可以為農(nóng)田土壤固碳消污提供技術(shù)支持和理論支撐。