本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于核酸檢測(cè)的crispr介導(dǎo)的單管一步法檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、crispr/cas技術(shù)，尤其與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合時(shí)，在分子診斷和生物傳感方面具有超靈敏、高特異和易于操作的優(yōu)勢(shì)。目前有部分研究已經(jīng)將crispr/cas診斷技術(shù)用于多種病原體的檢測(cè)，包括基于crispr/cas12a的detectr平臺(tái)用于檢測(cè)人類乳頭瘤病毒（hpv），基于crispr/cas12a的mccd平臺(tái)用于診斷新型冠狀病毒感染（covid-19），以及基于crispr/cas13a的sherlock平臺(tái)用于檢測(cè)登革熱病毒（denv）、寨卡病毒（zikv）和人類乳頭瘤病毒（hpv）等。

2、遺憾的是，現(xiàn)有的crispr/cas診斷技術(shù)通常分為兩步：首先利用pcr技術(shù)或恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)靶標(biāo)預(yù)擴(kuò)增，然后利用crispr/cas系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增信號(hào)。這種兩步法的技術(shù)容易導(dǎo)致交叉污染，同時(shí)也使檢測(cè)程序復(fù)雜化。此外，crispr系統(tǒng)介導(dǎo)的信號(hào)檢測(cè)的效率取決于cas效應(yīng)蛋白對(duì)單鏈dna（ssdna）或rna（ssrna）的非特異性剪切能力，因此需要在靶序列附近存在特定的pam。所以，常規(guī)的crispr檢測(cè)技術(shù)無(wú)法對(duì)缺乏pam序列的靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。因此，目前迫切需要一種能夠?qū)am序列整合到外部引物中、有效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)序列、并在單個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)與crispr/cas檢測(cè)無(wú)縫集成的新型技術(shù)，預(yù)期這種技術(shù)將具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

3、自2023年5月以來(lái)，兒童呼吸道疾病病例激增，這波引人注目的兒童肺炎主要?dú)w因于肺炎支原體（ mycoplasma?pneumoniae, m.?pneumoniae）的延遲復(fù)發(fā)。肺炎支原體是引起兒童呼吸道感染尤其是社區(qū)獲得性肺炎的常見(jiàn)病原體，這是一種非典型病原體，是最小的能夠自我復(fù)制的原核生物，缺乏細(xì)胞壁且生長(zhǎng)緩慢。雖然肺炎支原體引起的感染通常較輕，很少需要住院治療，但由于對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率極高，最近暴發(fā)的肺炎支原體感染在兒童中尤為嚴(yán)重。因此，迫切需要有效的管理策略，包括加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、改進(jìn)診斷檢測(cè)和預(yù)防措施，這對(duì)于遏制肺炎支原體誘發(fā)感染的傳播和減少感染的影響和嚴(yán)重程度至關(guān)重要。

4、目前，可用于肺炎支原體檢測(cè)的診斷方法包括細(xì)菌培養(yǎng)、分子診斷技術(shù)以及血清學(xué)檢測(cè)。其中，血清學(xué)檢測(cè)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（rt-pcr）法應(yīng)用最廣泛，在肺炎支原體檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。然而，這些方法存在一些局限性，包括靈敏度有限，嚴(yán)重依賴昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，這些因素可能會(huì)影響肺炎支原體檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可及性。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)更加精確和操作簡(jiǎn)便的肺炎支原體檢測(cè)方法，以提高現(xiàn)有的檢測(cè)效力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種新的crispr/cas檢測(cè)技術(shù)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

3、具體地，第一方面，本發(fā)明提供了一種非診斷目的的基于crispr的單管一步法檢測(cè)靶序列的方法，其包括：

4、（1）將待測(cè)樣本的dna模版、mcda引物、dna聚合酶、apacas12b-grna復(fù)合物、熒光探針混合，得到反應(yīng)體系；

5、（2）在恒定溫度下，將（1）中反應(yīng)體系進(jìn)行mcda介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增、基于crispr/cas12b的反式切割反應(yīng)；

6、所述的mcda引物包括置換引物、擴(kuò)增引物、交叉引物，所述的交叉引物包含pam位點(diǎn)，apacas12b-grna復(fù)合物中g(shù)rna與靶序列互補(bǔ)，所述的熒光探針為ssdna探針。

7、在本發(fā)明中，所述的交叉引物包含兩條引物，所述的交叉引物包含pam位點(diǎn)是指交叉引物中的一條引物包含pam位點(diǎn)。

8、在本發(fā)明中，所述的待測(cè)樣本為臨床樣本。所述的臨床樣本包括但不限于鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液。

9、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的方法還包括獲得待測(cè)樣本的dna模版。

10、在本發(fā)明中，apacas12b-grna?復(fù)合物的制備方法為：將grna與aapcas12b混合均勻，然后用aapcas12b和雙蒸水調(diào)整至固定體積，在37℃下孵育10分鐘后使用。制備好的cas12b-grna復(fù)合物應(yīng)立即使用或在4℃下儲(chǔ)存不超過(guò)12h。

11、在一些實(shí)施方式中，所述的pam位點(diǎn)為ttc。

12、在一些實(shí)施方式中，所述的熒光探針的兩端修飾有熒光基團(tuán)、熒光猝滅基團(tuán)。

13、在本發(fā)明中，所述的熒光基團(tuán)包括hex、joe、tet、rox、tam或fam中的任意一種；所述的熒光猝滅基團(tuán)包括bhq1、bhq2或mgb中的任意一種。

14、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述的熒光基團(tuán)為fam，所述的熒光猝滅基團(tuán)為bhq1。

15、在一些實(shí)施方式中，所述的置換引物包括f1和f2，所述的擴(kuò)增引物包括c1，d1，r1，c2，d2和r2，所述的交叉引物包括cp1*和cp2；所述的f1的序列如seq?id?no.1所示，所述的f2的序列如seq?id?no.2所示，所述的c1的序列如seq?id?no.6所示，所述的d1的序列如seqid?no.7所示，r1的序列如seq?id?no.8所示，所述的c2的序列如seq?id?no.9所示，所述的d2的序列如seq?id?no.10所示，所述的r2的序列如seq?id?no.11所示，所述的cp1*的序列如seq?id?no.4所示，所述的cp2的序列如seq?id?no.5所示；所述的apacas12b-grna復(fù)合物中的grna的序列如seq?id?no.12所示；所述的熒光探針的序列如seq?id?no.13所示。

16、在一些實(shí)施方式中，所述的恒定溫度為56℃至61℃。

17、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的恒定溫度為60℃。

18、在一些實(shí)施方式中，在所述的反應(yīng)體系中，所述的mcda引物的終濃度為：每條置換引物0.18?μm，每條擴(kuò)增引物0.36?μm，每條交叉引物0.72?μm。

19、在一些實(shí)施方式中，所述的方法還包括使用熒光儀器檢測(cè)步驟（2）中反式切割反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。

20、第二方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括：mcda引物、dna聚合酶、apacas12b-grna復(fù)合物、熒光探針，所述的mcda引物包括置換引物、擴(kuò)增引物、交叉引物，所述的交叉引物包含pam位點(diǎn)，apacas12b-grna復(fù)合物中g(shù)rna與靶序列互補(bǔ)，所述的熒光探針為ssdna探針。

21、在一些實(shí)施方式中，所述的置換引物包括f1和f2，所述的擴(kuò)增引物包括c1，d1，r1，c2，d2和r2，所述的交叉引物包括cp1*和cp2，其中，所述f1的序列如seq?id?no.1所示，所述的f2的序列如seq?id?no.2所示，所述的c1的序列如seq?id?no.6所示，所述的d1的序列如seq?id?no.7所示，r1的序列如seq?id?no.8所示，所述的c2的序列如seq?id?no.9所示，所述的d2的序列如seq?id?no.10所示，所述的r2的序列如seq?id?no.11所示，所述的cp1*的序列如seq?id?no.4所示，所述的cp2的序列如seq?id?no.5所示；所述的apacas12b-grna復(fù)合物中的grna的序列如seq?id?no.12所示；所述的熒光探針的序列如seq?id?no.13所示。

22、第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面所述的試劑盒在制備檢測(cè)肺炎支原體的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

23、在一些實(shí)施方式中，所述的產(chǎn)品包括試劑盒、檢測(cè)裝置。

24、有益效果

25、本發(fā)明首次公開(kāi)了一種基于crispr的新型檢測(cè)系統(tǒng)，稱為crispr-one（crispr介導(dǎo)的單管一步法檢測(cè)），它將多重交叉置換擴(kuò)增（multiple?cross?displacementamplification，mcda）與crispr/cas12b系統(tǒng)集成在一起。crispr-one檢測(cè)平臺(tái)能夠在恒定溫度下、單個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)擴(kuò)增和crispr介導(dǎo)的信號(hào)檢測(cè)。crispr-one檢測(cè)的結(jié)果可以使用實(shí)時(shí)熒光儀器直接可視化讀取。值得注意的是，crispr-one檢測(cè)平臺(tái)可以檢測(cè)本身缺乏pam位點(diǎn)的靶基因，因?yàn)樵摍z測(cè)平臺(tái)中使用的工程引物被修改為包含pam位點(diǎn)（圖1）。