本發(fā)明屬于但不限于分子育種，尤其涉及一種蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蘋果(malus×domesticaborkh.)是全球性的經(jīng)濟作物，2022年我國蘋果栽培面積已達(dá)212.91萬公頃，居世界首位。蘋果果實硬度作為衡量果實內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，影響果實成熟期并決定果實的貯藏特性，決定消費者的選擇及商品的市場競爭力，而提高果實品質(zhì)是增強市場競爭力和推動產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

2、蘋果雜交育種是果實品質(zhì)改良最重要和最有效的途徑，國內(nèi)外蘋果育種單位以“大群體”雜交為主，創(chuàng)制了大量的雜交后代，但蘋果屬于多年生的木本植物，具有遺傳背景復(fù)雜、高度雜合等特點，因此，品種選育成本和工作量較大，使得育種周期較長，嚴(yán)重影響蘋果新品種選育進(jìn)程。隨著測序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，伴隨基因組測序在蘋果上的應(yīng)用，目前在蘋果育種方面應(yīng)用的選育方法均是建立在常規(guī)雜交基礎(chǔ)上，利用遺傳圖譜、集群分離分析法或全基因組關(guān)聯(lián)分析等方法挖掘蘋果相關(guān)性狀關(guān)鍵基因的變異位點。其中，競爭性等位基因特異性pcr(kompetitive?allele?specific?pcr，kasp)技術(shù)是一種主要基于單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，snp)的高通量基因分型技術(shù)。kasp分型是根據(jù)引物末端堿基的特異性進(jìn)行匹配，該方法簡單、快捷且準(zhǔn)確率高。通過kasp可以對蘋果果實硬度和成熟期進(jìn)行快速檢測，運用在目標(biāo)性狀的早期選擇上，可大大縮短育種年限、提高育種效率，為蘋果分子育種的應(yīng)用提供重要參考。

3、目前與蘋果果實硬度和成熟期相關(guān)性狀的snp被大量定位，但是絕大多數(shù)能夠運用于早期選擇的snp卻較少，原因是絕大多數(shù)的snp因其對表型的貢獻(xiàn)率較小、不同群體間的重復(fù)性或不同年份間的重復(fù)性差，因其準(zhǔn)確性差而難以在育種早期對蘋果果實硬度和成熟期進(jìn)行快速檢測并應(yīng)用于育種改良。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，尤其涉及一種蘋果果實硬度大小和成熟期早晚識別的snp分子標(biāo)記。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的分子標(biāo)記，基因mdnac5編碼區(qū)5’端起第517位堿基處snp位點，所述snp位點的基因型與蘋果果實硬度和成熟期性狀緊密連鎖；所述基因序列如seq?id?no:1(atggagtgcaccgactcgtccgcgggctcacaacagcaacagcaccagc?agccgccacctccgcagccaaacctgccgcccgggttccgcttccacccgacggacgaagagctagtcgtccactatctcaagaaaaaggccacctccgctcccctcccggttgctattatcgctgaagtcgacctttacaagttcgacccctgggagctcccagctaaggctacgtttggagagcaagagtggtattttttcagtcctagggaccggaagtacccgaacggagcgagacccaatagggcagcgacttccgggtattggaaagcgacggggactgataagccggtgctgacttccggcgatactcagaaagttggtgtgaaaaaagcacttgtgttctatggaggaaaacccccaaaaggaattaaaaccaattggattatgcacgagtacaggcttgctgataacaagcccaacaacaagccacctgggtgtgacttgggcaacaagaagaactcc(a/t)tgaggcttgatgattgggtgctgtgtagaatt?tacaagaagaacaacacgcataggccgatggatcatgagagggaggattccatggaggacataatgggaccattgatgccaccatccataagtcatgtgggccaccatcagaatatgaagctgcactttccaaaatctaattcgagttatggaccgcctttcatggaaaatgaccaaatattttttgatgggataatgagcagcaccgacggatcagcttctactcatcagctgcaactaaaacggccaatagttccatcttggtactggaataatcaggaagatgatcagacggctgctgatccttcatcaagcaagagaatacaactgcaccaattggacaatggtactaattctaatggtgctgggattaatggtggttctacaaataacaattctagttctattgccaatctactttcccagcttccacagacgccaccattgcaccaacatgcagttctggggtcacttggcgacggtatattccggacgccatatcaactgcctggaatgaattggtattctgagtccaatttgggatag)所示。

3、進(jìn)一步，基因序列中5’端起的第517位堿基基因型為a/a，蘋果種質(zhì)基因型為純合，果實硬度小、成熟期為早熟。

4、進(jìn)一步，基因序列中5’端起的第517位堿基基因型為a/t，蘋果種質(zhì)基因型為雜合，果實硬度居中、成熟期為中熟。

5、進(jìn)一步，基因序列中5’端起的第517位堿基基因型為t/t，蘋果種質(zhì)基因型為純合，果實硬度大、成熟期為晚熟。

6、進(jìn)一步，蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的分子標(biāo)記的引物包括上游分型引物f1、上游分型引物f2和下游通用引物r，

7、上游分型引物f1的核酸序列為a517-f1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctgacttgggcaacaagaagaactcca-3’；

8、上游分型引物f2的核酸序列為a517-f2：5’-gaaggtcggagtcaacggattgacttgggcaacaagaagaactcct-3’；

9、下游通用引物r的核酸序列為a517-r：5’-ttcttgtaaattctacacagcaccc-3’。

10、本發(fā)明的另一目的在于提供一種蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的分子標(biāo)記在蘋果育種中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的另一目的在于提供一種蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的snp分子標(biāo)記在鑒定蘋果果實硬度大小和成熟期早晚的種質(zhì)資源中應(yīng)用。

12、進(jìn)一步，所述蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的snp分子標(biāo)記在鑒定蘋果果實硬度大小和成熟期早晚的種質(zhì)資源中應(yīng)用的方法，包括以下步驟：提取待測樣本的基因組dna；以提取的dna為模板，使用引物組合a517-f1、a517-f2和a517-r進(jìn)行pcr擴增；對pcr產(chǎn)物進(jìn)行基因分型以判斷待測樣本的果實硬度和成熟期。

13、本發(fā)明的另一目的在于提供一種蘋果果實硬度和成熟期快速檢測的snp分子標(biāo)記在蘋果分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于調(diào)控蘋果果實硬度大小和成熟期早晚的基因mdnac5，所述基因mdnac5為md03g1222600，利用基因工程的手段，通過過表達(dá)蘋果的兩種基因型mdnac5促進(jìn)蘋果硬度減小和果實成熟期提前。

15、結(jié)合上述的技術(shù)方案和解決的技術(shù)問題，本發(fā)明所要保護(hù)的技術(shù)方案所具備的優(yōu)點及積極效果為：

16、第一、本發(fā)明利用illumina?hiseq?2500測序平臺對‘富士’和‘粉紅女士’的294份f1雜交后代的基因組進(jìn)行重測序，通過堿基識別、去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、與參考基因組比對后構(gòu)建高密度遺傳圖譜。本發(fā)明利用質(zhì)構(gòu)儀測定了雜交后代果實的硬度大小，并統(tǒng)計果實的成熟期，對獲得的表型數(shù)據(jù)與圖譜進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，定位到對果實硬度大小和成熟期早晚貢獻(xiàn)率顯著的基因mdnac5，mdnac5編碼區(qū)5’端起第517位堿基處snp可以區(qū)分雜交后代果實硬度大小和果實成熟期早晚。因此，本發(fā)明通過這個snp位點開發(fā)了選育蘋果果實硬度大小和成熟期早晚蘋果品種的分子標(biāo)記。另外，本發(fā)明通過kasp技術(shù)對其他雜交后代和種質(zhì)資源中驗證了mdnac5編碼區(qū)第517位的snp。驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高硬度、晚成熟種質(zhì)snp位置堿基為t/t或a/t，低硬度和早熟種質(zhì)snp位置堿基為a/a，可利用這個snp位點開發(fā)蘋果果實硬度大小和成熟期早晚的分子標(biāo)記。

17、本發(fā)明利用kasp技術(shù)對變異位點的snp設(shè)計特異性引物進(jìn)行pcr擴增或測序的方法，解決了選育蘋果果實硬度大小和成熟期早晚品種的問題，并可篩選蘋果果實硬度適宜和成熟期較晚的蘋果種質(zhì)資源。

18、第二，本發(fā)明的技術(shù)方案轉(zhuǎn)化后的預(yù)期收益和商業(yè)價值為：本發(fā)明中mdnac5編碼區(qū)5’端起第517位堿基處snp可以區(qū)分雜交后代果實硬度大小和果實成熟期早晚，通過該位點設(shè)計特異性引物進(jìn)行pcr擴增并進(jìn)行測序或kasp鑒定，該方法可使得蘋果早期育種更加高效和有針對性；通過識別具有適中硬度和成熟期的后代，加速育種進(jìn)程，縮短縮短雜交育種年限；傳統(tǒng)的育種方法依賴于大量表型篩選，而本發(fā)明中的kasp標(biāo)記通過基因分型實現(xiàn)早期篩選，可以極大程度減輕蘋果雜交選育工作量和育種成本。與傳統(tǒng)的snp標(biāo)記技術(shù)相比，kasp標(biāo)記在成本效益和準(zhǔn)確性方面具有優(yōu)勢。此外，kasp標(biāo)記技術(shù)有助于基因功能的研究和驗證，為蘋果果實硬度的基礎(chǔ)研究提供支持，進(jìn)而推動農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步和技術(shù)創(chuàng)新，通過高效的基因型分析，kasp標(biāo)記有助于深入了解作物的遺傳特性，推動蘋果遺傳改良研究。

19、本發(fā)明的技術(shù)方案填補了國內(nèi)外業(yè)內(nèi)技術(shù)空白：傳統(tǒng)的分子標(biāo)記開發(fā)通常需要復(fù)雜的實驗流程和大量的實驗驗證，而kasp標(biāo)記技術(shù)通過優(yōu)化的pcr方法簡化了這一過程；其他基因分型方法如snp芯片和傳統(tǒng)pcr等其成本較高、操作復(fù)雜和通量較低，kasp標(biāo)記以其高精度和高通量的特點填補了這一空白。此外，蘋果果實硬度及成熟期相關(guān)基因的功能研究需要精確的基因分型和表型數(shù)據(jù)，而kasp標(biāo)記的高精度分型為基因功能研究提供了必要的技術(shù)支持。因此，kasp標(biāo)記對蘋果果實硬度和成熟期的快速分型填補了傳統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)在雜交育種應(yīng)用中的不足。