本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及馬類常見傳染性病原體，如馬鏈球菌馬亞種、馬腦脊髓炎病毒、馬傳染性貧血病毒、鼻疽桿菌、非洲馬瘟病毒、馬流產(chǎn)沙門氏菌的檢測(cè)并進(jìn)行區(qū)分的組合物和用途。

背景技術(shù)：

1、馬腺疫(equine?strangles，es)，也稱為噴喉或喉骨脹，是由馬鏈球菌馬亞種(streptococcus?equi?subspecies?equi，see)引起的一種急性傳染病，主要影響馬、驢和騾。典型癥狀包括體溫升高、頜下淋巴結(jié)的急性化膿性炎癥、以及上呼吸道咽黏膜的卡他性化膿性炎癥。

2、馬腦脊髓炎(equine?encephalomyelitis，ee)，也稱為borna病，是一種由馬腦脊髓炎病毒(equine?encephalitis?viruses，eev)感染導(dǎo)致的人畜共患的病毒性疾病。這種疾病最初在1894年至1896年間在歐洲被發(fā)現(xiàn)，并隨后在北美、南美、日本和蘇聯(lián)等地陸續(xù)出現(xiàn)不同類型的病毒性馬腦脊髓炎，具有全球分布的特點(diǎn)。從健康影響的角度來看，該病主要導(dǎo)致患病動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，出現(xiàn)興奮或沉郁等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致意識(shí)障礙。此外，患病動(dòng)物還會(huì)出現(xiàn)明顯的黃疸，胃腸遲緩和消化不良等癥狀。這些癥狀嚴(yán)重影響了馬匹的生活質(zhì)量和生產(chǎn)性能，甚至可能導(dǎo)致死亡。由于氣候變化等因素，馬腦脊髓炎的傳播風(fēng)險(xiǎn)正在增加。例如，東部馬腦炎病毒(eastern?equine?encephalitis?virus，eeev)的活動(dòng)在過去十年中有所增加，包括在人類和馬匹群體中的大規(guī)模爆發(fā)。這一現(xiàn)象反映了病毒性疾病在氣候變化背景下全球范圍內(nèi)的傳播趨勢(shì)，這對(duì)馬腦脊髓炎的防控提出了挑戰(zhàn)。

3、馬傳染性貧血(equine?infectious?anemia，eia)是一種由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科(lentivirus)中的馬傳染性貧血病毒(equine?infectious?anemia?virus，eiav)引起的傳染病，主要影響馬、騾和驢。該病的傳播途徑多樣，包括昆蟲叮咬(如虻、蚊、蠓等)、病馬的排泄物、使用帶有病毒的針頭或其他設(shè)備。此外，不善的馬匹管理、舍內(nèi)潮濕、衛(wèi)生條件差、過度勞累和寄生蟲病感染也是導(dǎo)致此病高發(fā)的重要誘因。其臨床特征主要為間歇熱、貧血、出血、黃疸、心臟衰弱、浮腫、消瘦等。該疾病對(duì)馬類動(dòng)物的威脅性很大，尤其是急性馬傳染性貧血，有很高的致死率。

4、馬鼻疽(glanders)是由假單胞菌屬(pseudomonas)的鼻疽桿菌(pseudomonasmallei，pm)感染引起的一種嚴(yán)重人獸共患傳染病，主要影響馬、騾、驢等動(dòng)物。臨床癥狀為在鼻腔、喉頭、氣管粘膜或皮膚上形成鼻疽結(jié)節(jié)、潰瘍和瘢痕，以及在肺、淋巴結(jié)或其它實(shí)質(zhì)器官發(fā)生鼻疽性結(jié)節(jié)。馬鼻疽可分為急性和慢性，急性馬鼻疽可導(dǎo)致咳嗽、發(fā)燒和釋放感染性鼻分泌物，隨后出現(xiàn)敗血癥并在幾天內(nèi)死亡；慢性馬鼻疽可導(dǎo)致鼻和皮下結(jié)節(jié)發(fā)展并最終潰爛，死亡時(shí)間在幾個(gè)月內(nèi)。根據(jù)法國阿爾福國立獸醫(yī)學(xué)校記錄，馬鼻疽是馬中最常見的疾病，也是最可能導(dǎo)致死亡的疾病。

5、非洲馬瘟(african?horse?sickness，ahs)是一種由非洲馬瘟病毒(africanhorse?sickness?virus，ahsv)引起的馬屬動(dòng)物的急性傳染病，主要通過庫蠓等吸血昆蟲叮咬傳播。該病毒屬于輪狀病毒科orbivirus屬，已識(shí)別出九種血清型。非洲馬瘟有四種典型的臨床表現(xiàn)形式：肺型、心型、混合型和馬病熱型。急性肺型只發(fā)生在完全易感的動(dòng)物身上，病程短，死亡率高。心型水腫型病程較亞急性，死亡率可達(dá)50％?；旌闲图毙孕褪亲畛Ｒ姷模哂行男秃头涡蛢煞N形式的特征，死亡率可達(dá)70％。感染初期可能出現(xiàn)高熱、食欲不振、精神萎靡等癥狀，隨后可能出現(xiàn)呼吸困難、皮膚和黏膜出現(xiàn)瘀斑等嚴(yán)重表現(xiàn)。由于其高致死率，非洲馬瘟?xí)?duì)馬匹相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成重大損失，屬于需要嚴(yán)格監(jiān)控的病原體。

6、馬副傷寒(equine?paratyphoid，ep)是沙門氏菌病的一種，主要由馬流產(chǎn)沙門氏菌(salmonella?abortusequi，sae)感染馬類所引起，表現(xiàn)為孕馬流產(chǎn)，流產(chǎn)前大多有體溫升高、乳房腫脹、陰道流出血色液體等先兆，快速檢測(cè)該病原體以進(jìn)行預(yù)防是馬類相關(guān)行業(yè)的重點(diǎn)工作。

7、這6種常見的馬傳染性疾病病原體皆對(duì)馬類相關(guān)畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)、以及服務(wù)業(yè)有重大影響，但其中許多疾病無根治方法，主要以預(yù)防為主。由于致病病原體種類繁多，給疾病的診斷和預(yù)防帶來巨大的挑戰(zhàn)。因此，本領(lǐng)域需求一種能夠簡單、快速地檢測(cè)上述病原體并且靈敏度高、特異性好的產(chǎn)品，有利于及時(shí)提供預(yù)防政策。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，第一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的組合物，包括檢測(cè)如下馬類常見傳染性病原體中至少4種的上下游引物和探針：

2、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)馬鏈球菌馬亞種的上下游引物和探針；

3、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)馬腦脊髓炎病毒的上下游引物和探針；

4、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)馬傳染性貧血病毒的上下游引物和探針；

5、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)鼻疽桿菌的上下游引物和探針；

6、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)非洲馬瘟病毒的上下游引物和探針；或

7、如seq?id?no:16～18所示的檢測(cè)馬流產(chǎn)沙門氏菌的上下游引物和探針。

8、本發(fā)明提供的聯(lián)檢組合物，主要利用多重?zé)晒鈖cr分析方法對(duì)馬類常見傳染性病原體進(jìn)行檢測(cè)，從而在單管反應(yīng)體系中同時(shí)實(shí)現(xiàn)馬鏈球菌馬亞種、馬腦脊髓炎病毒、馬傳染性貧血病毒、鼻疽桿菌、非洲馬瘟病毒、馬流產(chǎn)沙門氏菌中至少4種病原體的檢測(cè)和區(qū)分，以便為后續(xù)治療提供針對(duì)性策略。同時(shí)，本發(fā)明的組合物，其檢測(cè)的靈敏度更高，達(dá)到400拷貝/ml，檢測(cè)更為準(zhǔn)確，有利于及時(shí)提供預(yù)防政策。

9、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的組合物，包括：

10、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)馬鏈球菌馬亞種的上下游引物和探針；

11、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)馬腦脊髓炎病毒上下游引物和探針；

12、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)馬傳染性貧血病毒的上下游引物和探針；

13、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)鼻疽桿菌的上下游引物和探針；

14、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)非洲馬瘟病毒的上下游引物和探針；以及

15、如seq?id?no:16～18所示的檢測(cè)馬流產(chǎn)沙門氏菌的上下游引物和探針。

16、進(jìn)一步地，所述組合物包括檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上下游引物及探針。

17、進(jìn)一步地，本發(fā)明組合物不同探針的熒光基團(tuán)彼此互不相同且互不干擾。

18、在本文中，“互不相同且互不干擾”是指組合物中每個(gè)探針?biāo)玫臒晒饣鶊F(tuán)是不一樣的，并且不會(huì)影響彼此的檢測(cè)，即可以利用不同的通道進(jìn)行檢測(cè)。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox、cy5以及cy5.5等，這些基團(tuán)吸光值不接近，能選擇不同的通道，因而不會(huì)互相干擾。

19、進(jìn)一步地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以同時(shí)包括上述引物和探針對(duì)中的一對(duì)或多對(duì)。在本發(fā)明中，“對(duì)”是指檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的上游、下游引物和探針。

20、本發(fā)明的組合物可以任意組合成檢測(cè)對(duì)應(yīng)6個(gè)靶點(diǎn)的任意組合形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行組合，檢測(cè)哪幾個(gè)靶點(diǎn)，即把對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的引物和探針對(duì)進(jìn)行組合即可。這些組合形式均包括在本發(fā)明中。

21、舉例來說，可以包括上述6對(duì)引物和探針中的任意5對(duì)，可以包括上述6對(duì)引物和探針中的任意4對(duì)，可以包括上述6對(duì)引物和探針中的任意3對(duì)，可以包括上述6對(duì)引物和探針中的任意2對(duì)，也可以包括上述6對(duì)引物和探針中的任意1對(duì)。

22、在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物用于熒光pcr。

23、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，馬鏈球菌馬亞種探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為fam；馬腦脊髓炎病毒的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為hex；馬傳染性貧血病毒探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為rox；鼻疽桿菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為cy5；非洲馬瘟病毒探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為atto?425；馬流產(chǎn)沙門氏菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為quasar705。

24、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有非熒光淬滅劑。

25、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有淬滅基團(tuán)，例如mgb、dabcyl?bhq-0、bhq1、bhq2或bhq3。

26、進(jìn)一步地，所述組合物中單條引物的用量為0.2～0.5μm；所述組合物中單條探針的用量為0.06～0.2μm。

27、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分分別存在于單獨(dú)包裝中。

28、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分存在于同一個(gè)包裝中。

29、進(jìn)一步地，本發(fā)明的組合物的各成分以混合的形式存在。

30、第二方面，本發(fā)明提供了上述本發(fā)明的組合物在制備檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的試劑盒中的用途，其中，所述馬類常見傳染性病原體的類型為馬鏈球菌馬亞種、馬腦脊髓炎病毒、馬傳染性貧血病毒、鼻疽桿菌、非洲馬瘟病毒、馬流產(chǎn)沙門氏菌。

31、第三方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述本發(fā)明的組合物。

32、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。

33、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，陰性質(zhì)控品是depc?h2o、生理鹽水、內(nèi)標(biāo)基因中的至少一種。陽性質(zhì)控品是馬鏈球菌馬亞種、馬腦脊髓炎病毒、馬傳染性貧血病毒、鼻疽桿菌、非洲馬瘟病毒、馬流產(chǎn)沙門氏菌的質(zhì)粒、標(biāo)準(zhǔn)株或假病中的至少一種。

34、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括核酸擴(kuò)增試劑。

35、更進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增試劑包括dntp(u)s、pcr緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、udg酶，以及mg2+中的至少一種。

36、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：核酸釋放試劑、核酸提取試劑。

37、進(jìn)一步地，所述dna聚合酶的濃度為3u/反應(yīng)～15u/反應(yīng)，例如dna聚合酶可以是taq酶。所述逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為6u/反應(yīng)～10u/反應(yīng)，例如逆轉(zhuǎn)錄酶可以是neoscript?rt酶；所述ung酶的濃度為0.4u-2u/反應(yīng)。

38、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括：taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、ung酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探針和pcr緩沖液。

39、pcr緩沖液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton?x-100等組分構(gòu)成。一般單個(gè)pcr反應(yīng)管中總體積為20μl～200μl。

40、第四方面，提供了一種用于檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

41、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

42、2)使用如上所述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

43、3)獲得并分析結(jié)果。

44、在本發(fā)明中，用于檢測(cè)的樣本可以是鼻拭子、陰道拭子、腦脊液、糞便、血清、血液等，但不限于此。

45、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

46、cdna逆轉(zhuǎn)錄和ung酶反應(yīng)，溫度為50～65℃，時(shí)間為10～15分鐘，1次循環(huán)；taq酶活化，溫度為90～99℃，時(shí)間為5～120秒，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

47、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了一種用于以非診斷目的檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

48、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

49、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

50、3)獲得并分析結(jié)果。

51、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

52、cdna逆轉(zhuǎn)錄和ung酶反應(yīng)，溫度為50～65℃，時(shí)間為10～15分鐘，1次循環(huán)；taq酶活化，溫度為90～99℃，時(shí)間為5～120秒，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

53、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了一種組合物用于制備檢測(cè)馬類常見傳染性病原體的試劑的用途，所述檢測(cè)以下步驟：

54、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

55、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光定量pcr；

56、3)獲得并分析結(jié)果。

57、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

58、cdna逆轉(zhuǎn)錄和ung酶反應(yīng)，溫度為50～65℃，時(shí)間為10～15分鐘，1次循環(huán)；taq酶活化，溫度為90～99℃，時(shí)間為5～120秒，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時(shí)間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。