本發(fā)明涉及基因工程，特別是一種坦布蘇病毒單輪感染顆粒制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、坦布蘇病毒病是由黃病毒科黃病毒屬成員坦布蘇病毒(tembusuvirus，tmuv)引起的，以致種禽產(chǎn)蛋下降綜合征為主要特點(diǎn)。tmuv為黃病毒屬病毒，表達(dá)報(bào)告基因如egfp、熒光素酶的重組黃病毒已被成功構(gòu)建，并廣泛應(yīng)用于病毒復(fù)制機(jī)制、宿主抗病毒機(jī)制、抗病毒藥物篩選等領(lǐng)域的研究。

2、cn201711226242.2公開了一種攜帶海腎熒光素酶的鴨坦布蘇病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染復(fù)制子及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述復(fù)制子是在坦布蘇病毒刪除編碼結(jié)構(gòu)基因后在編碼c蛋白n端前38個(gè)氨基酸的序列之后連入海腎熒光素酶報(bào)告基因，并在rluc后插入編碼口蹄疫病毒自剪接肽的序列fmdv2a，在坦布蘇病毒的復(fù)制子5’utr序列上游添加真核啟動(dòng)子cmv及原核啟動(dòng)子t7，在3’utr下游添加丁型肝炎病毒核酶序列hdvr及sv40poly(a)序列，獲得的復(fù)制子能夠精確定量反映復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況，可方便的應(yīng)用于研究坦布蘇病毒乃至其他黃病毒的復(fù)制機(jī)理、抗病毒藥物篩選、病毒與蛋白互作等。然而，該方案未涉及復(fù)制子包裝為感染性顆粒的方法。

3、因此，亟待提供一種穩(wěn)定傳代的表達(dá)外源基因的重組坦布蘇病毒單輪感染顆粒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種坦布蘇病毒單輪感染顆粒制備方法及其應(yīng)用。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)施的：

3、本發(fā)明的目的之一是要提供一種坦布蘇病毒單輪感染顆粒制備方法，包括以下步驟：

4、s1、制備表達(dá)fiber2蛋白的重組坦布蘇病毒復(fù)制子質(zhì)粒ptmuvrep-fiber2；

5、s2、利用表達(dá)坦布蘇病毒cprme蛋白的重組慢病毒lv-cprme轉(zhuǎn)導(dǎo)至bhk21細(xì)胞，經(jīng)過加藥篩選和單克隆，獲得穩(wěn)定表達(dá)坦布蘇病毒cprme蛋白的bhk21-cprme細(xì)胞系；

6、s3、使用lipo8000轉(zhuǎn)染試劑將ptmuvrep-fiber2轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)坦布蘇病毒cprme蛋白的bhk21-cprme細(xì)胞；獲得p0代坦布蘇病毒單輪感染顆粒tmuvrep-fiber2；將p0代單輪感染顆粒tmuvrep-fiber2在bhk21-cprme細(xì)胞上傳代擴(kuò)增5代，得到p5代坦布蘇病毒單輪感染顆粒tmuvrep-fiber2。

7、進(jìn)一步地，所述步驟s1具體包括：

8、s11、以pacyc-cmv-tmuv質(zhì)粒為模板，使用如seq?id?no.1所示的tmuv-c25-r、如seq?id?no.2所示的rz-sv40-f為引物，pcr擴(kuò)增得到片段p1；

9、s12、以pacyc-cmv-tmuv質(zhì)粒為模板，使用如seq?id?no.3所示的rz-sv40-r、如seqid?no.4所示的tmuv-22e-f為引物，pcr擴(kuò)增得到片段p2；

10、s13、提取fadv-4病毒的dna，以fadv-4病毒的dna為模板，如seq?id?no.5所示的fiber2-f、如seq?id?no.6所示的fiber2-p2a1-r為引物，pcr擴(kuò)增得到片段p3；

11、s14、以片段p3為模板，使用如seq?id?no.7所示的c22-fiber2-f、如seq?id?no.8所示的fiber2-p2a2-r為引物，pcr擴(kuò)增得到片段p4；

12、s15、以片段p4為模板，使用如seq?id?no.7所示的c22-fiber2-f、如seq?id?no.9所示的p2a-22e-r為引物，pcr擴(kuò)增得到片段p5；

13、s16、使用無縫克隆試劑clonexpress?ultra?one?step?cloning?kit?v2將片段p1、片段p2、片段p5進(jìn)行同源重組連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至sure感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)fiber2蛋白的重組坦布蘇病毒復(fù)制子質(zhì)粒ptmuvrep-fiber2。

14、進(jìn)一步地，所述步驟s2具體包括：

15、s21、以pacyc-tmuv為模板，使用如seq?id?no.10所示的plv-c-f、如seq?id?no.11所示的plv-e-r為引物，pcr擴(kuò)增得到片段p6；

16、s22、使用bamh?i限制性內(nèi)切酶，在37℃的條件下對慢病毒包裝質(zhì)粒plv-ef1a-mcs-ires-bsd單酶切，通過電泳膠回收獲得線性化載體plv-cmv-mcs-ef1-puro；

17、s23、使用無縫克隆試劑clonexpress?ultra?one?step?cloning?kit?v2將片段p6、線性化載體plv-cmv-mcs-ef1-puro進(jìn)行同源重組連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至sure感受態(tài)細(xì)胞，獲得cprme重組慢病毒載體plv-cprme；

18、s24、將生長對數(shù)期的hek293t細(xì)胞均勻接種在t25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至匯合度80％后，將質(zhì)量比為4:2:2的plv-cprme、pspax2和pmd2.g混合后共轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞，孵育4-6小時(shí)后，換新鮮的含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48h收集慢病毒上清液，獲得重組慢病毒lv-cprme，放于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

19、s25、將生長良好的bhk21細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板，培養(yǎng)基為含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，每孔接種20萬個(gè)細(xì)胞，記為對照組；將生長良好的bhk21細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板，培養(yǎng)基為含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，每孔接種20萬個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70-90％時(shí)，將重組慢病毒lv-cprme與聚凝胺混合使聚凝胺濃度為8mg/ml后接種至bhk21細(xì)胞，記為轉(zhuǎn)染慢病毒組；將對照組和轉(zhuǎn)染慢病毒組培養(yǎng)24h后同時(shí)更換新鮮的含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48h，細(xì)胞穩(wěn)定生長后更換含有10μg/ml滅稻瘟菌素和含有10％fbs的dmem篩選培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)至對照組的細(xì)胞全部死亡，此時(shí)轉(zhuǎn)染慢病毒組存活的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞即為能表達(dá)cprme蛋白的陽性細(xì)胞；

20、s26、初步篩選得到陽性細(xì)胞后，用有限稀釋法將篩選后的細(xì)胞懸液傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，保證每孔只有0～1個(gè)細(xì)胞，以抗性篩選生長液再培養(yǎng)10～14d，觀察挑取生長狀態(tài)良好的單細(xì)胞克隆接種至24孔板，待細(xì)胞孔長滿后進(jìn)行鑒定，最終挑選得到14株單克隆細(xì)胞；通過westernblot檢測細(xì)胞cprme表達(dá)水平，獲得穩(wěn)定表達(dá)坦布蘇病毒cprme蛋白的bhk21-cprme細(xì)胞系。

21、進(jìn)一步地，所述步驟s3具體包括：

22、s31、選擇消化生長狀態(tài)良好的bhk21-cprme細(xì)胞，向6孔板中每孔鋪3×105個(gè)bhk21-cprme細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)后，使用lipo8000轉(zhuǎn)染試劑將ptmuvrep-fiber2轉(zhuǎn)染至bhk21-cprme細(xì)胞；轉(zhuǎn)染72h后，將細(xì)胞板至80℃反復(fù)凍融兩次，4000g離心收集病毒上清，獲得p0代坦布蘇病毒單輪感染顆粒tmuvrep-fiber2；將p0代坦布蘇病毒單輪感染顆粒tmuvrep-fiber2在bhk21-cprme細(xì)胞上傳代擴(kuò)增5代，得到p5代坦布蘇病毒單輪感染顆粒tmuvrep-fiber2。

23、本發(fā)明的目的之二是要提供一種利用上述方法制備的坦布蘇病毒單輪感染顆粒。

24、本發(fā)明的目的之三是要提供一種坦布蘇病毒單輪感染顆粒在作為疫苗用載體中的應(yīng)用。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種表達(dá)外源基因的坦布蘇病毒單輪感染顆粒的構(gòu)建方法，本發(fā)明的方法能方便、快速地構(gòu)建攜帶外源基因的坦布蘇病毒復(fù)制子質(zhì)粒，并通過包裝細(xì)胞bhk21-cprme高效率地產(chǎn)生表達(dá)外源基因的坦布蘇病毒單輪感染顆粒?？捎糜诓《局虏⌒浴?fù)制等領(lǐng)域的研究，也可用于疫苗、基因治療產(chǎn)品的開發(fā)。