本發(fā)明涉及穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的細胞系、豬瘟納米顆粒疫苗，尤其涉及表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系以及由此制備的表面遞呈e2蛋白的鐵蛋白納米顆粒疫苗，屬于豬瘟疫苗領域。

背景技術：

1、豬瘟(classical?swine?fever,csf)是由豬瘟病毒(classical?swine?fevervirus,csfv)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其主要臨床癥狀為發(fā)熱、厭食、共濟失調和呼吸系統(tǒng)問題(blome?s,staubach?c,henke?j?et?al.,classical?swinefever-an?updated?review.viruses.2017；9(4):86.)。被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告的傳染病之一。在實施疫苗免疫和嚴格的撲殺策略后，許多地區(qū)和國家成功根除了csf。然而，csf在亞洲、南美洲、中美洲和加勒比地區(qū)仍然流行。目前，csf已經從典型的急性致命感染轉變?yōu)槁猿掷m(xù)感染(coronado?l,bohórquez?ja,s,et?al.,investigation?of?chronic?and?persistent?classical?swine?fever?infectionsunder?field?conditions?and?their?impact?on?vaccine?efficacy.bmc?vet?res.2019；15(1):247.)，這導致?lián)錃⒌牟呗詠砀i瘟的工作面臨著新的挑戰(zhàn)，因此需要一種和c株免疫效果相當的亞單位疫苗來建立廣泛的群體免疫。csf在日本消失26年后，再次出現(xiàn)，在家豬和野豬身上都檢測到了csfv樣本，這突出了當今csf流行的復雜性。目前csfv策略的目標已經從簡單的預防轉變?yōu)楦@對于目前廣泛應用的c株疫苗來說，是一項具有挑戰(zhàn)性的任務。

2、c株疫苗在中國的廣泛應用有效地控制了csf，導致近年來沒有發(fā)生大規(guī)模疫情。然而，c株疫苗無法通過血清學方法進行diva(meyer?d,fritsche?s,luo?y?et?al.,thedouble-antigen?elisa?concept?for?early?detection?of?erns-specific?classicalswine?fever?virus?antibodies?and?application?as?an?accompanying?test?fordifferentiation?of?infected?from?marker?vaccinated?animals.transbound?emergdis.2017；64(6):2013-2022.)。為了加強對csf的預防和控制，更好地為根除csf做好準備，市場對具有diva特征的疫苗的需求越來越大。

3、與具有毒力返強風險的減毒活疫苗不同，亞單位疫苗由源自病原體的免疫原性多肽、蛋白質或多糖組成。然而，亞單位疫苗通常表現(xiàn)出低免疫原性，因此通常需要添加佐劑來誘導保護性免疫反應(reed?sg,tomai?m,gale?mj?jr.new?horizons?in?adjuvants?forvaccine?development.curr?opin?immunol.2020；65:97-101.)。即使使用佐劑，亞單位疫苗誘導保護性免疫反應也在很大程度上受限于遞送方式。因此，合適的疫苗遞送平臺對于亞單位疫苗的研發(fā)至關重要。納米顆粒疫苗平臺通過各種方式來達到抗原在納米顆粒上的展示與呈遞的目的，包括化學修飾和基因融合(liu?zh,xu?hl,han?gw,et?al.self-assembling?nanovaccine?enhances?protective?efficacy?against?csfv?inpigs.front?immunol.2021；12:689187.)。在非融合表達的前提下，納米顆粒疫苗通常被當作一種通用的疫苗平臺來研發(fā)(wang?et?al.,2019)。

4、納米顆粒疫苗平臺已廣泛應用于各種疾病的研發(fā)，尤其是癌癥疫苗，包括預防和治療疫苗?；诩{米顆粒的疫苗的關鍵優(yōu)勢之一可以誘導有效和持久的免疫反應。作為一種基于蛋白質的疫苗，納米顆粒疫苗誘導體液免疫的能力強于普通亞單位疫苗。主要有以下幾方面因素。首先，較小尺寸的np更容易被apc識別和捕獲。此外，np具有直接進入淋巴結的獨特能力，從而為生發(fā)中心b細胞(gc?b細胞)提供持續(xù)而有力的刺激，誘導更高水平的體細胞超突變，并快速產生分泌更特異中和抗體的b細胞。此外，先前的報道表明，np在被樹突狀細胞捕獲后，有一定的概率發(fā)生交叉遞呈從而通過mhc-i遞呈抗原，然后誘導細胞免疫。一般來說，蛋白質抗原是不穩(wěn)定的，在身體復雜的體液微環(huán)境中容易降解。這種不穩(wěn)定性可導致向抗原呈遞細胞(apc)的遞送減少和無效的免疫反應?；诩{米粒子的遞送平臺為此問題提供了解決方案。目前，納米顆粒疫苗的臨床試驗已經開始，這表明納米顆粒疫苗具有巨大的應用前景。

5、豬瘟病毒e2蛋白位于病毒包膜表面，在病毒感染過程中起著至關重要的作用。作為一種保護性抗原，它能夠誘導中和抗體(gavrilov?bk,rogers?k,fernandez-sainz?ijet?al.,effects?of?glycosylation?on?antigenicity?and?immunogenicity?ofclassical?swine?fever?virus?envelope?proteins.virology.2011；420(2):135-45)，因此以e2蛋白為主要成分的新型疫苗已被廣泛開發(fā)。已經證實，基于e2蛋白的亞單位疫苗具有diva特性。然而，基于e2蛋白的疫苗需要一定的時間才能誘導保護性免疫反應，不能像c株疫苗那樣快速提供保護。鑒于c株無法區(qū)分感染動物和接種疫苗的動物(diva)，亞單位疫苗誘導保護性免疫的速度較慢，因此，市場需要一種既有diva特性又能確?？焖俦Ｗo的豬瘟疫苗。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一株穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系；

2、本發(fā)明的目的之二是提供表面遞呈e2蛋白的鐵蛋白納米顆粒疫苗；

3、本發(fā)明的目的之三是將所述的穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系或表面遞呈e2蛋白的鐵蛋白納米顆粒疫苗應用于制備防治豬瘟疫苗或藥物。

4、本發(fā)明的上述目的是主要通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

5、本發(fā)明的一方面是提供了一株穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系，其微生物保藏編號是cgmcc?no.45825；其分類命名是：穩(wěn)定表達融合sp標簽的豬瘟e2蛋白的cho懸浮細胞系；保藏時間是：2024年3月11日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

6、本發(fā)明的另一方面是將所述的穩(wěn)定表達融合sp標簽的豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系應用于制備豬瘟疫苗，包括：誘導懸浮cho細胞系表達st-e2蛋白；將懸浮cho細胞系所表達的st-e2蛋白與載體或免疫佐劑偶聯(lián)或混合，即得。

7、本發(fā)明的再一方面是提供了表面遞呈e2蛋白的鐵蛋白納米顆粒疫苗，包括：由穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系所表達的st-e2蛋白和鐵蛋白偶聯(lián)得到。

8、本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方案，所述的鐵蛋白是將△n-spycatcher蛋白融合到鐵蛋白的n-末端，將△n-spyccatcher蛋白展示在納米顆粒的表面上；其中，所述△n-spycatcher蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.1所示，所述鐵蛋白的氨基酸序列為seq?idno.2所示。

9、本發(fā)明的再一方面是提供了一種制備所述表面遞呈e2蛋白的鐵蛋白納米顆粒疫苗的方法，包括：

10、將由穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系所表達的st-e2蛋白和鐵蛋白按照(2-8):1的摩爾比在緩沖液中孵育，即得。

11、本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實施方案，將由穩(wěn)定表達豬瘟病毒e2蛋白的懸浮cho細胞系所表達的st-e2蛋白和鐵蛋白按照4:1的摩爾比在緩沖液中4℃孵育，即得。

12、其中，所述的緩沖液優(yōu)選為ph值為7.3的50mm?pbs緩沖液。

13、本發(fā)明選擇來自幽門螺桿菌的鐵蛋白在納米顆粒表面呈遞抗原，同時將spycatcher/spytag偶聯(lián)系統(tǒng)用于鐵蛋白和e2蛋白的結合，而不是直接融合表達，有效避免蛋白表達水平低的問題。

14、本發(fā)明首先構建了穩(wěn)定表達csfv?e2蛋白的cho懸浮細胞系，并采用spycatcher/spytag技術構建了一個以ferritin為載體的通用亞單位疫苗遞送平臺，以此為基礎構建了表面遞呈e2蛋白的鐵蛋白納米顆粒(fe-e2nps)，并評估了其在兔中的免疫原性，試驗結果發(fā)現(xiàn)，用20μg?fe-e2?nps進行的單次免疫在兔體內引發(fā)更高滴度的中和抗體。在每個采樣時間，fe-e2?nps免疫組的中和抗體滴度顯著高于e2蛋白免疫組。值得注意的是，在免疫后7天和14天，fe-e2?nps比c株疫苗更早地誘導了高滴度中和抗體，在免疫后的第7天，20μgfe-e2?nps免疫組中和抗體滴度顯著高于c株免疫組(平均中和滴度為1：700)(p＜0.01和p＜0.05)。這證明了fe-e2?nps誘導的早期和強大的免疫反應。重要的是，在免疫后7天，20μgfe-e2?nps納米顆粒免疫組表現(xiàn)出與c株相當的ifn-γ水平。這表明fe-e2?nps可以在免疫早期發(fā)揮與c株疫苗相當的抗病毒作用。此外，fe-e2?nps不僅能誘導ifn-γ，而且在免疫后第7天能快速誘導高水平的中和抗體，平均抗體滴度為1:700?，F(xiàn)有技術研究表明，中和抗體滴度≥1:50可以有效對抗豬瘟強毒感染。因此，20μg?fe-e2?nps可以通過體液或細胞免疫反應快速誘導對豬瘟的完全保護性免疫。相比之下，c株疫苗缺乏diva特性，這是其用于消除豬瘟病毒的主要限制，而fe-e2-np疫苗有效地彌補了這一不足；本發(fā)明的試驗結果表明，本發(fā)明提供的fe-e2nps納米顆粒疫苗可以在兔體內誘導比c株疫苗更好的免疫保護，不僅可以誘導ifn-γ以提供對豬瘟的早期保護，而且可以更快地誘導有效的體液免疫，兼顧了減毒活疫苗和亞單位疫苗的優(yōu)點，有可能成為豬瘟的有效替代疫苗，提供diva特性，有望在控制和根除csf方面發(fā)揮重要作用。