本發(fā)明涉及抗體，尤其是涉及一種pcna結合蛋白、制備方法和應用。

背景技術：

1、如下陳述僅提供與本發(fā)明有關的背景信息，而不必然地構成現(xiàn)有技術。

2、增殖細胞核抗原(proliferating?cell?nuclearantigen，pcna)，又被稱為細胞周期蛋白(cyclin)2，最早在1978年由miyachi等采用雙擴散免疫沉淀技術發(fā)現(xiàn)于sle患者血清中，因其存在于增殖活躍的細胞中而得名。傳統(tǒng)的pcna蛋白，分子量34kda，被證實是dna聚合酶8的輔蛋白或加工因子(processivity?factor?of?dna?polymerase?delta)，它在真核細胞中高度保守，以三個單體相互連接，形成一個同源三聚體環(huán)狀結構，可作為環(huán)繞雙鏈dna的滑動鉗(sliding?clamp)，在dna復制、染色質重塑、dna損傷修復，以及細胞周期進展中發(fā)揮作用。pcna蛋白是決定細胞生死的核心分子之一，其表達的調控機制為：pcna基因由p53誘導，而pcna蛋白在決定細胞命運的過程中與p53調控蛋白gadd45、myd118、cr6，以及最重要的p21相互作用。一方面，若pcna蛋白在p53缺失的情況下大量存在于細胞中，dna復制就會發(fā)生。另一方面，若p53存在時細胞中pcna蛋白水平很高，dna修復就會發(fā)生。若pcna喪失功能或在細胞中缺失或少量存在，則細胞發(fā)生凋亡。

3、抗pcna抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性抗體，可作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的標記性抗體，若檢測陽性，則有可能患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡，但其陽性率較低。近年來也有研究證實抗pcna抗體并非系統(tǒng)性紅斑狼瘡所特有，可在其他多種其他自身免疫性疾病中出現(xiàn)。抗pcna抗體也可見于慢性乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)、丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)感染患者。此外抗pcna抗體曾在惡性腫瘤(如小細胞肺癌)患者中檢出。

4、目前抗pcna抗體檢測試劑盒中的校準品和質控品主要采用患者血清，由于陽性血清的獲取比較困難，來源不穩(wěn)定，且每份血清的性能難以穩(wěn)定。因此開發(fā)出可規(guī)?；a，批間差異小以及高親和力的抗pcna重組單抗對臨床檢測試劑盒的開發(fā)具有著重要意義和價值。

5、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供pcna結合蛋白，該結合蛋白與pcna具有良好的特異性結合能力?；诒景l(fā)明提供的pcna結合蛋白，本發(fā)明的目的還在于提供其應用。本發(fā)明的另一目的在于以操作更簡單的方法開發(fā)結合活性好的pcna結合蛋白，可用于pcna抗原的鑒定，以及輔助進行pcna抗體陽性疾病的診斷或輔助診斷。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明特采用如下技術方案：

3、名詞定義：

4、在本文中pcna指的是增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，pcna)，也稱為又被稱為細胞周期蛋白(cyclin)2。分子量34kda，在真核細胞中高度保守，以三個單體相互連接，形成一個同源三聚體環(huán)狀結構，pcna與細胞dna合成關系密切,在細胞增殖的啟動上起重要作用，參與許多細胞重要事件，如細胞dna損傷修復、細胞周期調控、染色體重組、dna甲基化以及細胞凋亡等。

5、本發(fā)明提供的pcna結合蛋白能夠與pcna特異性結合，pcna結合蛋白結合的pcna包括由細胞天然表達或經pcna基因轉染的細胞表達的pcna。pcna結合蛋白結合的pcna還包括經人工改造的pcna，所述人工改造包括但不限于突變、截短或者與其他結構域融合后的多肽或蛋白，且保留與抗體結合的必要的抗原表位。

6、在本文中“結合蛋白”此技術術語是指結合特定抗原的蛋白，其泛指包含互補決定區(qū)(cdr區(qū))的一切蛋白及蛋白片段。蛋白及蛋白片段可以為抗體，“抗體”和“全長抗體”此用語包括多克隆抗體及單克隆抗體。此外，“抗體”此用語包括天然發(fā)生的抗體以及非天然發(fā)生的抗體，包括例如嵌合型(chimeric)、雙功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗體，以及相關的合成異構形式(isoforms)。非天然發(fā)生的抗體在本文中也被稱為“重組抗體”，“抗體”此用語可和“免疫球蛋白”互換使用。

7、蛋白及蛋白片段也可以是包含抗體cdr的一部分或全部的抗原結合片段，其缺乏至少一些存在于全長鏈中的氨基酸但仍能夠特異性結合至抗原。此類片段具生物活性，因為其結合至靶抗原，且可與其他抗原結合分子(包括完整抗體)競爭結合至給定表位。此類片段選自但不限于f(ab’)2、fab’、fab、fv(由vh和vl構成)，scfv(單鏈抗體，vh和vl之間由一連接肽連接而成)、dsfv(二硫鍵穩(wěn)定性fv抗體(disulfide?stabilized?fv?fragments,dsfv))、雙特異抗體、納米抗體和抗體最小識別單位中的任意一種。除上述功能片段外，還包括半衰期已增加的任何片段。

8、結合蛋白的“可變區(qū)(variable?region)”或“可變結構域”是指抗體的重鏈或輕鏈的氨基端識別并結合抗原的結構域，該區(qū)段氨基酸的組成和排列決定了抗體識別抗原的特異性。重鏈可變結構域可以被稱為“vh”。輕鏈的可變結構域可以被稱為“vl”。這些結構域通常是抗體的最可變的部分，并含有抗原結合位點。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自通過4個骨架區(qū)(framework?region，fr)連接的3個互補性決定區(qū)(complementarity-determiningregion，cdr)(也被稱作高變區(qū))組成。骨架區(qū)和cdr的范圍已被精確定義，例如在kabat(參見《免疫重要的蛋白質的序列》((sequences?of?proteins?of?immunological?interest)，e.kabat等)和chothia中，本領域眾所周知的任何cdr確定方法，包括方法的組合，可以鑒別可變結構域的cdr。每個鏈中的cdr通過fr保持緊密靠在一起構成可變區(qū)，通常情況下，重鏈和輕鏈的可變區(qū)vl/vh可由以下編號的cdr與fr按如下組合排列連接獲得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。

9、術語抗體的“恒定區(qū)”或“恒定結構域”表示單獨的或組合的抗體輕鏈的恒定區(qū)或抗體重鏈的恒定區(qū)?？贵w的重鏈具有一個可變結構域(vh)，繼之以許多恒定結構域或區(qū)域，例如鉸鏈、ch1、ch2、ch3和ch4中的一個或多個，ch1結構域鄰近vh結構域且在抗體重鏈的鉸鏈區(qū)的氨基端，且不形成抗體的fc區(qū)的部分；鉸鏈區(qū)包括將ch1結構域連接至ch2結構域的重鏈分子的部分；ch2的n端通常為ch3結構域，ch3結構域通常形成抗體的c-端部分，在一些抗體類型中，例如igm和ige中恒定區(qū)還包括ch4結構域?？贵w的恒定區(qū)可以源自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd，以及它們的亞類和突變形式的恒定區(qū)。

10、本發(fā)明不限制pcna結合蛋白的獲得方式。在一些可選的實施方式中，利用編碼pcna結合蛋白的多核苷酸與載體連接后，在細胞表達能夠獲得相應抗體?？梢詫⑸鲜鲚d體導入到真核細胞、尤其是哺乳動物細胞中，構建獲得能夠表達所述pcna結合蛋白。在另一些可選的實施方式中，結合蛋白還可以通過本領域技術人員所知的重組遺傳學技術或通過肽合成，如自動肽合成儀獲得(例如applied?biosystems等銷售的自動肽合成儀)；抗原結合片段還可選地通過抗原結合分子(包括完整抗體)的酶裂解產生，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶裂解；或化學裂解產生，例如通過化學還原分裂二硫鍵的方法獲得上述的抗原結合片段。

11、術語“特異性識別”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”或其類似表述是指結合蛋白對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，結合蛋白以大約小于10-5m，例如大約小于10-5m、10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的kd值結合。使用本領域中充分確立的方法可以確定抗體的kd值。用于評價配體諸如抗體對靶標的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如，elisa、蛋白質印跡、ria和流式細胞計量術分析。

12、本文中術語“多核苷酸”指的是任何長度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸。多核苷酸的實例包括但不限于單鏈、雙鏈或多鏈dna或rna、基因組dna、cdna、dna-rna雜合體或者包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然、化學或生化修飾、非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸編碼上述pcna結合蛋白，編碼可選地為編碼正義鏈或反義鏈。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重組的或它們的任意組合。術語“多核苷酸”和“核酸”本文中可互換地使用。

13、本文中術語“載體(vector)”是指，可將多核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在細胞中獲得表達。

14、所述載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(yac)、細菌人工染色體(bac)或p1來源的人工染色體(pac)；噬菌體如λ噬菌體或m13噬菌體及動物病毒等?？捎米鬏d體的動物病毒包括但不限于，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒。在一些實施方式中，本發(fā)明所述載體中包含基因工程中常用的調控元件，例如增強子、啟動子、內部核糖體進入位點(ires)和其他表達控制元件(例如轉錄終止信號，或者多腺苷酸化信號和多聚u序列等)。

15、本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有這類名稱都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突變不一定與原代細胞完全相同，在形態(tài)學上和/或在基因組dna上與原代細胞存在差異。“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養(yǎng)物。

16、本文中，與多肽或核酸相關聯(lián)的術語“純化的”或“分離的”是指多肽或核酸不是處于其天然介質中或天然形式下。因此，術語“分離的”包括從其原始環(huán)境，例如如果它是天然存在的，從天然環(huán)境取出的多肽或核酸。例如，分離的多肽通常不含通常與其結合或通常與其混合或在溶液中的至少某些蛋白質或其他細胞組分。分離的多肽包括細胞裂解物中包含的天然生產的所述多肽，純化或部分純化形式的所述多肽，重組多肽，被細胞表達或分泌的所述多肽，以及在異源細胞或培養(yǎng)物中的所述多肽。與核酸相關聯(lián)，術語分離的或純化的指示例如所述核酸不在其天然的基因組背景中(例如在載體中，作為表達盒，連接到啟動子，或人工引入到異源細胞中)。

17、本文中“pcna抗體陽性疾病”是指能夠導致患者pcna抗體高于未患疾病時水平的疾病，示例性的pcna抗體陽性疾病包括但不限于自身免疫性疾病(例如紅斑狼瘡)，病毒感染(例如慢性乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染)或癌癥(例如小細胞肺癌)。

18、第一方面，提供了一種pcna結合蛋白，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

19、所述重鏈可變區(qū)包括互補決定區(qū)vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3；所述輕鏈可變區(qū)包括互補決定區(qū)vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3；

20、所述vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3包括與seq?id?no.1所示的重鏈可變區(qū)的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3一致的氨基酸序列；所述vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3包括與seqid?no.2所示的輕鏈可變區(qū)的vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3一致的氨基酸序列。

21、可以理解的是，seq?id?no.1或2所示的可變區(qū)中的除去cdr區(qū)域的其他區(qū)域的氨基酸序列不用于限定本發(fā)明提供的pcna結合蛋白，例如本技術提供的pcna結合蛋白若含有骨架區(qū)，其可以和seq?id?no.1或2所示可變區(qū)中的骨架區(qū)不同。seq?id?no.1或2所示的可變區(qū)中的cdr區(qū)域可以根據本領域已知的、任選的方式進行劃分。可選地，可變區(qū)的vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3由kabat、chothia、imgt、abm或contact任意一種系統(tǒng)或多種定義系統(tǒng)組合定義。分別以kabat、chothia、imgt、abm或contact定義方式為例，seq?id?no.1所示的重鏈可變區(qū)的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3的氨基酸序列和seq?id?no.2所示的輕鏈可變區(qū)的vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3的氨基酸序列如表1所示：

22、表1

23、

24、

25、可選的實施方式中，所述pcna結合蛋白具有表1中定義的重鏈可變區(qū)的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3，和具有表1中定義的輕鏈可變區(qū)的vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3。以imgt定義方式為例：所述vh-cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.11所示，所述vh-cdr2的氨基酸序列如seq?id?no.16所示，所述vh-cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.19所示；所述vl-cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.22所示，所述vl-cdr2的氨基酸序列為ats，所述vl-cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.25所示。

26、可選的實施方式中，所述重鏈可變區(qū)還含有骨架區(qū)，和/或，所述輕鏈可變區(qū)還含有骨架區(qū)。所述骨架區(qū)的種屬來源包括但不限于兔、牛、馬、乳牛、豬、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、貓、駱駝、驢、鹿、貂、雞、鴨、鵝、火雞、斗雞、人和它們的突變體的中的一種或多種。

27、可選的實施方式中，所述pcna結合蛋白的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

28、可選的實施方式中，pcna結合蛋白為包括恒定區(qū)的抗體或抗原結合片段。

29、可選的實施方式中，pcna結合蛋白的恒定區(qū)序列的至少一部分是人恒定區(qū)序列。

30、可選的實施方式中，pcna結合蛋白的恒定區(qū)序列選自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd任何其中之一的部分或全部恒定區(qū)的序列，所述igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd包括它們的亞類和突變形式。

31、可選的實施方式中，所述pcna結合蛋白含有重鏈恒定區(qū)。

32、可選的實施方式中，所述pcna結合蛋白的重鏈恒定區(qū)序列選自人igg1的恒定區(qū)序列的部分或全部序列，優(yōu)選包括人igg1的恒定區(qū)的包括ch1、ch2和ch3。

33、可選的實施方式中，重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

34、可選的實施方式中，所述pcna結合蛋白含有輕鏈恒定區(qū)。

35、可選的實施方式中，所述輕鏈恒定區(qū)序列選自小鼠的輕鏈恒定區(qū)。

36、可選的實施方式中，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

37、可選的實施方式中，所述pcna結合蛋白為人鼠嵌合抗體，所述pcna結合蛋白的重鏈氨基酸序列如seq?id?no.5所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

38、第二方面，還提供了一種生物材料，包括多核苷酸、載體或細胞；其中，所述多核苷酸編碼上述pcna結合蛋白；所述載體攜帶所述多核苷酸；所述細胞攜帶所述多核苷酸、或含有所述載體或能夠表達所述pcna結合蛋白。

39、利用編碼pcna結合蛋白的多核苷酸與載體連接后，可以將上述載體導入到真核細胞、尤其是哺乳動物細胞中，構建獲得能夠表達pcna結合蛋白的細胞系，在細胞表達能夠獲得相應蛋白。

40、可選的實施方式中，用于表達pcna結合蛋白的細胞為293細胞(人腎上皮細胞系)，優(yōu)選為293f細胞。

41、可選的實施方式中，用于表達pcna結合蛋白的細胞為cho細胞(中國倉鼠卵巢細胞)。

42、第三方面，還提供了第一方面的pcna結合蛋白的制備方法，包括培養(yǎng)能夠表達所述pcna結合蛋白的細胞。

43、可選的實施方式中，所述制備方法還包括將編碼含有所述pcna結合蛋白的多核苷酸轉化至細胞并表達，通過純化獲得pcna結合蛋白。

44、可選的實施方式中，所述制備方法還包括根據需要合成含有所述pcna結合蛋白編碼基因的多核苷酸，和/或，根據需要制備合適的表達載體，將表達載體轉化至所需的細胞中并表達，通過純化可得到所述pcna結合蛋白。

45、可選的實施方式中，所述細胞為將編碼包括如第一方面的所述的pcna結合蛋白的多核苷酸轉化至細胞制得，所述多核苷酸包括重鏈表達質粒和輕鏈表達質粒，所述轉化包括將所述重鏈表達質粒和所述輕鏈表達質粒共轉化至細胞。

46、可選的實施方式中，包括將重鏈可變區(qū)c端融合恒定區(qū)片段，構建完整的重鏈表達質粒。

47、可選的實施方式中，所述恒定區(qū)片段包括ch1、ch2和ch3中的一種或多種，優(yōu)選包括ch1、ch2和ch3。

48、可選的實施方式中，所述細胞為真核細胞，優(yōu)選為哺乳動物細胞。

49、可選的實施方式中，所述哺乳動物細胞包括293細胞或cho細胞，優(yōu)選為293f細胞。

50、第四方面，還提供了第一方面的pcna結合蛋白、或第二方面的生物材料在如下(ⅰ)～(ⅶ)任意一項中的應用：

51、(ⅰ)非診斷和治療目的地檢測pcna抗體；

52、(ⅱ)制備用于檢測pcna抗體的產品；

53、(ⅲ)制備診斷pcna抗體陽性疾病的產品；

54、(iv)非診斷和治療目的地檢測pcna；

55、(ⅶ)制備用于檢測pcna的產品；

56、(ⅵ)用于純化pcna；

57、(ⅶ)制備用于純化pcna的產品；

58、對于檢測pcna抗體或在診斷pcna抗體陽性疾病中，pcna結合蛋白能夠作為檢測時的標準品和/或質控品使用，以為檢測結果提供可靠的參考，也可以用于構建標準曲線。

59、可選的實施方式中，所述制備診斷pcna抗體陽性疾病的產品包括制備診斷或輔助診斷自身免疫性疾病的產品。所述pcna抗體陽性疾病包括制備診斷或輔助診斷自身免疫性疾病、病毒感染或癌癥。所述自身免疫性疾病可選地包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡；所述病毒感染可選地包括慢性乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染；所述癌癥可選地包括小細胞肺癌。

60、上述第(iv)方面的應用可以利用pcna結合蛋白能夠特異性靶向結合pcna，基于免疫檢測技術實現(xiàn)pcna或表達pcna的細胞的檢測，如當pcna結合蛋白為免疫偶聯(lián)物，例如連接有熒光基團，可以采用熒光檢測裝置實現(xiàn)對pcna的定位或實時檢測。例如可以用于免疫印跡、免疫沉淀或流式細胞技術等涉及到利用pcna抗原和抗體的特異性結合性能來檢測pcna?；趐cna結合蛋白能夠特異性靶向結合pcna，其還可以用于第(ⅵ)方面的純化pcna。

61、可選的實施方式中，上述第(ⅱ)、(ⅲ)、(ⅴ)或(ⅶ)方面，本領域技術人員可以根據實際的用途制備相應的產品(如上述提到的免疫偶聯(lián)物)，并選配產品中的其他試劑組成，包括但不限于示蹤標記物、固相載體、緩沖試劑、鹽、二抗、顯色底物、封閉液、洗滌液、溶劑、洗脫液、偶聯(lián)劑、陰性對照、陽性對照、標準品、質控品和標記物中的一種或多種。

62、第五方面，還提供了一種試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒包含第一方面的pcna結合蛋白、或第二方面的生物材料。

63、可選的實施方式中，所述試劑盒用于檢測pcna抗體或用于檢測pcna抗體陽性疾病；所述自身抗體陽性疾病包括但不限于特發(fā)性炎癥性肌病、抗合成酶綜合征、肌炎、紅斑狼瘡、干燥綜合征、新生兒紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性膽管炎、特發(fā)性炎癥性肌病和類風濕關節(jié)炎中的一種或多種以及其他自身免疫性疾病。所述試劑盒包括標準品和/或質控品，所述標準品和/或所述質控品含有所述pcna結合蛋白。

64、可選的實施方式中，所述試劑盒還包括檢測試劑，所述檢測試劑包括pcna抗體檢測試劑。

65、可選的實施方式中，所述試劑盒還包括如下至少一種物質的抗體的檢測試劑：dsdna、核小體、組蛋白、sm、核糖體p蛋白、scl-70、ss-a-52、ss-a-60、cenp-b、ama?m2、ssb、jo-1、pm-scl、mi-2、ku和rnp/sm中的至少一種。

66、可選的實施方式中，所述試劑盒還包括固相載體。

67、可選的實施方式中，所述試劑或試劑盒中的pcna結合蛋白與固相載體偶聯(lián)；或所述試劑或試劑盒中的pcna結合蛋白與固相載體分別獨立的包裝。通過將所述pcna結合蛋白與固相載體偶聯(lián)，可用于捕獲待測樣本中的pcna蛋白。或者通過將所述pcna結合蛋白與固相載體偶聯(lián)，可用于純化pcna蛋白。

68、可選的實施方式中，所述pcna抗體檢測試劑包括偶聯(lián)有pcna抗原的固相載體。

69、可選的實施方式中，所述試劑盒還包括示蹤標記物。

70、可選的實施方式中，所述試劑或試劑盒中的pcna結合蛋白與示蹤標記物偶聯(lián)；或所述試劑或試劑盒中的pcna結合蛋白與示蹤標記物分別獨立的包裝。通過將所述pcna結合蛋白與示蹤標記物偶聯(lián)，可用于定位檢測pcna蛋白或通過蛋白印跡檢測樣品中的pcna蛋白。

71、上述試劑或試劑盒還任選地包括本領域用于檢測反應或純化蛋白使用的，本領域技術人員熟知的試劑和/或耗材，包括但不限于緩沖試劑、鹽、二抗、顯色底物、封閉液、洗滌液、溶劑、洗脫液、偶聯(lián)劑、陰性對照、陽性對照、標準品、質控品和標記物中的一種或多種。

72、上述試劑或試劑盒可用于本領域可接受的、一般的免疫檢測方法中，包括但不限于免疫熒光染色、流式分選、免疫印記、免疫組化、elisa、免疫層析或免疫磁珠中，本領域技術人員可根據對應的檢測手段配制試劑或試劑盒中的其他試劑，本發(fā)明對此不做限制。

73、上述任一實施方式中的示蹤標記物包括但不限于酶、發(fā)光標記、熒光微球、彩色微球、乳膠微球、膠體金、量子點、生物素、鏈霉親和素、放射性核素、放射性造影劑、順磁離子、金屬和光敏劑中的一種或多種。

74、酶的實例例如可以為但不限于為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，發(fā)光標記例如可以為但不限于為熒光蛋白、合成類小分子或聚合物染料等，具體的實例包括但不限于alexa350、alexa?405、alexa430、alexa?488、alexa?555、alexa?647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy?650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、cascade?blue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、熒光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑)、oregon?green?488、oregon?green?500、oregon?green514、pacific?blue、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴狀化合物、三雙吡啶基二胺銪、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青苷、la?jolla藍染料、別藻藍蛋白、allococyanin?b、藻藍蛋白c、藻藍蛋白r、硫胺、藻紅青蛋白、藻紅蛋白r、reg、羅丹明綠、羅丹明異硫氰酸酯、羅丹明紅、rox、tamra、tet、trit(四甲基羅丹明異硫醇)、四甲基羅丹明和德克薩斯紅中的一種或多種。熒光微球、彩色微球和乳膠微球分別獨立的選自本領域可接受的產品，例如來源于市售的產品。放射性核素包括但不限于110in、111in、177lu、18f、52fe、62cu、64cu、67cu、67ga、68ga、86y、90y、89zr、94mtc、94tc、99mtc、120i、123i、124i、125i、131i、154-158gd、32p、11c、13n、15o、186re、188re、51mn、52mmn、55co、72as、75br、76br、82mrb和83sr中的一種或多種。順磁離子包括但不限于鉻(iii)、錳(ii)、鐵(iii)、鐵(ii)、鈷(ii)、鎳(ii)、銅(ii)、釹(iii)、釤(iii)、鐿(iii)、釓(iii)、釩(ii)、鋱(iii)、鏑(iii)、鈥(iii)和鉺(iii)中的一種或多種。

75、上述任一實施方式中的固相載體包括但不限于微管、柱、微粒、硝酸纖維素膜、層析基質或側流裝置；更具體的例如可以為但不限于為酶標孔、免疫層析試紙或磁珠。所述層析基質可選擇本領域可接受的，已知的任何層析基質，包括但不限于聚苯乙烯、多糖聚合物或硅膠等。可選的實施方式中，所述層析基質包括凝膠顆粒。

76、本發(fā)明公開了一種特異性識別結合pcna抗原的pcna結合蛋白，進一步制備得到人鼠嵌合的重組單抗。本發(fā)明具有如下有益效果：

77、(1)該方法制備pcna結合蛋白序列已知，可在體外進行重組表達，操作簡單，耗時短，生產工藝可控、產品批間差小，穩(wěn)定性好的優(yōu)點，應用前景較佳。

78、(2)該pcna結合蛋白可偶聯(lián)層析基質進行pcna抗原的免疫親和層析純化，提高蛋白純度。該pcna結合蛋白亦可偶聯(lián)標記物，用于pcna抗原的檢測，包括但不限于使用液相芯片、免疫熒光染色、流式分選、熒光微球等技術識別pcna抗原。

79、(3)作檢測試劑盒中的質控品，可緩解免疫多抗操作繁瑣，后續(xù)偶聯(lián)效率低的問題，降低生產成本，穩(wěn)定產品質量，并能夠顯著提高反應值；另一方面相較于直接使用人血清，也能夠避免樣本來源難和高成本問題。