本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領域，具體涉及一種檢測her2基因擴增新型fish探針的制備方法及其應用。

背景技術：

0、技術背景

1、在乳腺癌患者中，大約有20％-30％的患者有因her2基因擴增而導致her2基因過表達的現(xiàn)象，其中her2基因過表達的發(fā)生率較高。her2基因過表達誘導人體乳腺腫瘤發(fā)生，且相關研究證明her2基因過表達的乳腺癌患者預后較差。因此her2基因表達水平檢測成為評估乳腺癌患者預后的重要手段。由于her2基因的擴散和過表達現(xiàn)象與乳腺癌的預后有關，并對臨床治療有指導作用，因此美國臨床腫瘤協(xié)會(asco)和美國國家綜合癌癥網(nccn)建議所有乳腺癌患者都應對其her2基因狀態(tài)進行檢測。目前針對乳腺癌her2基因狀態(tài)的檢測技術大致分為以下層面：

2、1)her2基因dna水平的檢測，如熒光原位雜交(fish)、亮視野原位雜交(bish)等；

3、2)her2轉錄水平的檢測，如rna原位雜交(rna-ish)等。

4、3)her2蛋白水平的檢測，如免疫組織化學(ihc)；

5、而fda認證的檢測方法主要是ifc和fish，兩種檢測方法的簡要介紹如下：

6、1、fish：即熒光原位雜交，屬于物理圖譜繪制的一種方法，是一種應用熒光物質標記的探針靶點特異性核苷酸片段-探針，依據變性、復性、雙鏈互補的原理，在細胞核染色體上顯示序列位置的方法。該技術具有快速、安全、靈敏度高以及探針可長期保存等特點，是臨床分子病理診斷的技術方法之一，目前已廣泛應用于細胞遺傳學、腫瘤生物學、產前診斷等領域。

7、臨床上her2基因的檢測標準為：

8、陽性：基因拷貝數(shù)＞6.0，fish比率＞2.2；

9、可疑：基因拷貝數(shù)4.0～6.0，fish比率1.8～2.2；

10、陰性：基因拷貝數(shù)＜4.0，fish比率＜1.8。

11、2、ihc：即免疫組織化學法，其原理為抗原和抗體之間的相互作用，借助顯微鏡對抗原物質進行檢測，以觀察細胞中蛋白質、多肽等大分子物質的分布狀況。臨床上ihc檢測標準為：

12、陽性：整個胞膜中均呈現(xiàn)染色狀態(tài)，染色完全、顏色鮮明，超過10％癌細胞膜胞膜呈現(xiàn)強陽性；

13、可疑：染色不完全，染色溫和，≤10％癌細胞膜胞膜呈現(xiàn)強陽性；

14、陰性：染色不完全，染色模糊，超過10％癌細胞膜胞膜呈現(xiàn)強陽性；或整個細胞胞膜中均無染色狀況、染色不完全，≤10％癌細胞膜胞膜呈現(xiàn)強陽性。

15、除此之外，其他新的檢測方法也有進展。bish是近十幾年來出現(xiàn)的her2基因檢測的新技術，主要包括顯色原位雜交技術(cish)、銀增強原位雜交(sish)等方法。2013年10月asco/cap發(fā)布了乳腺癌her2基因檢測指南，將bish列為乳腺癌her2基因檢測的新技術；2000年，tanner首次報道了采用cish法檢測her2基因擴增的可行性，研究顯示cish與fish具有極強的一致性，可彌補ihc檢測結果的不穩(wěn)定性；隨后大量研究均證實了cish與fish的檢測結果具有高度的一致性(85％～100％)，且其在各實驗室之間重復性良好，具有廣泛的實際使用價值。然而，cish雖然解決了fish設備要求高、成本高昂的問題，但是該方法的主要缺點是沒有內對照，遇到17號染色體多體或者her2低水平擴增時不能得出準確結論，適合在無fish檢測條件的實驗室使用。綜上，fish在臨床上診斷乳腺癌her2基因狀態(tài)的應用更廣。

16、就目前國內市場而言，主要有3家有一定規(guī)模的公司經營銷售熒光原位雜交臨床診斷產品，分別是雅培(abbott)、金普嘉(gp)、安必平(lbp)醫(yī)藥科技有限公司。前者產品種類較全，但雅培標記試劑盒在臨床應用中內對照cen17的雜點較多，cen17是一種著絲粒探針，靶向17號染色體著絲粒區(qū)域，由大量重復序列組成，因此整體的特異性序列總數(shù)較少，常用于確定her2的數(shù)量；后二者產品種類相對較少，且價格較高。

17、目前傳統(tǒng)fish探針制備方法基于細菌質?；蚴删w重組人工基因組(bac或pac)技術，先對含有bac或pac的細菌或噬菌體進行擴大培養(yǎng)，后提取bac或pac來克隆靶序列，然后以此為模板，采用聚合酶缺口平移或鏈式反應pcr(隨機引物法)這兩種方法來生成無標記的探針，并對后者進行熒光標記，最終制備成用于檢測的探針。所述以bac克隆為模板、使用缺口平移技術生成的探針是目前國內外探針產品的主流，為第一代探針。這類探針的主要缺點是含有重復序列和非特異性序列，重復和非特異性序列是雜交背景和非特異性信號的來源，需要富含人類基因組重復序列的cot1?dna抑制背景和非特異性信號，從而增加了探針生產成本。同時，cot1?dna的抑制雖然能夠極大程度地降低雜交背景，但背景仍然較高，且無法完全消除非特異性信號。另外，這類探針的大小不等，探針片段長度處于50bp～1,000bp之間，細胞或組織穿透性不均，從而造成雜交效率等不平衡。后續(xù)對第一代探針的生產方法進行了改進，即仍然以bac為模板，將pcr產物，與cot1?dna混合，后經變性復性、雙鏈特異性dna水解酶的處理、去除重復序列以及熒光標記，最終得到不含重復序列的探針。不含重復序列探針降低了雜交背景，清除了非特異性信號，增加了探針的細胞穿透性，提高了雜交效率，為第二代探針。雖然第二代探針性能比第一代的好，但由于兩代探針的制備均以bac克隆為模板，進行擴增，而bac克隆的大小和數(shù)量都是固定和有限的，大小普遍在100-200kb左右；且bac的提取不僅需要大型設備，還費時費力，從而導致高制備成本。

18、人類全基因組測序完成及核酸合成技術的發(fā)展使人工合成熒光原位雜交探針成為可能，且人工合成的探針長度是可控的。利用現(xiàn)代生物信息學進行設計，通過化學合成生產寡核苷酸探針的新一代制備方法完全擺脫bac克隆的限制，但這類探針制備工藝需要反復進行合成，導致生產成本較高，供貨周期長，影響了臨床的廣泛應用。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術和產品的不足以及考慮到檢測her2基因擴增探針對醫(yī)學檢驗的重要性，本發(fā)明提供了一種用于檢測her2基因擴增的新型原位雜交(fish)探針及其制備方法，所述的探針制備工藝屬于oligo探針制備法，具體步驟如下：利用分子生物信息學技術對重復序列進行去除，并設計和化學合成長度一致的靶向目的片段的寡核苷酸片段，建立寡核苷酸庫，然后擴增和用熒光標記寡核苷酸序列，最后得到用于檢測her2基因擴增的熒光原位雜交探針。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測her2基因擴增的新型fish探針的制備方法，所述制備方法屬于oligo探針制備法，包含以下步驟：

3、(1)確定her2基因和cen17位點的探針靶點區(qū)域且去除探針靶點區(qū)域內的重復核苷酸序列，所述her2基因探針靶點區(qū)域包含her2基因的編碼區(qū)以及5’端和3’端的非編碼區(qū)域；

4、(2)根據her2基因/cen17位點探針靶點區(qū)域設計并化學合成長度一致的寡核苷酸片段，所述寡核苷酸序列長度為60～240bp；所述寡核苷酸片段包含接頭和特異性結合her2基因/cen17位點探針靶點區(qū)域的片段；所述寡核苷酸序列構成寡核苷酸庫；

5、化學合成可以統(tǒng)一探針的長度，使探針更好地進入檢測樣本，提高雜交效率；加接頭的目的是為了后續(xù)的擴增，接頭序列的存在可以一次性對所有含同一接頭的特異性核苷酸序列進行擴增，而不需要一對一地對探針設計擴增引物，減少了時間和金錢成本；而且，如果一個pcr擴增體系中，包含太多不同的擴增引物，會降低擴增效率。

6、(3)以步驟(2)中的寡核苷酸庫為模板，以步驟(2)的接頭序列為引物進行pcr擴增，得到探針模板庫；以探針模板庫為模板，使用含有熒光標記的正向、反向引物進行pcr擴增獲得以cen17為內對照，檢測her2基因擴增的原位雜交熒光探針，所述正向、反向引物序列同接頭序列。

7、第一次擴增是為了獲得多拷貝的探針模板庫，可以通過調整擴增次數(shù)達到目的濃度，所述探針模板庫可保存重復利用；第二步擴增目的為獲得單次使用的熒光探針。如果直接用帶熒光標記的引物擴增寡核苷酸庫，而不是先制備探針模板庫，得到的熒光探針濃度有限，探針濃度低的話，在熒光顯微鏡下觀察到的熒光較弱，從而不能很好地判斷her2基因的拷貝數(shù)是否增加，達不到檢測肺癌的效果；而且如果直接擴增寡核苷酸庫的話，對后者的損耗很大，不適合長期大批量的生產探針。

8、進一步地，步驟(2)設計的接頭序列和步驟(3)用于擴增探針模板庫的引物為，seqid?no:1所示的正向引物與seq?id?no:2所示的反向引物、seq?id?no:3所示的正向引物與seq?id?no:4所示的反向引物、seq?id?no:5所示的正向引物與seq?id?no:6所示的反向引物、seq?id?no:7所示的正向引物與seq?id?no:8所示的反向引物、seq?id?no:9所示的正向引物與seq?id?no:10所示的反向引物、seq?id?no:11所示的正向引物與seq?id?no:12所示的反向引物、seq?id?no:13所示的正向引物與seq?id?no:14所示的反向引物、seq?id?no:15所示的正向引物與seq?id?no:16所示的反向引物、seq?id?no:17所示的正向引物與seqid?no:18所示的反向引物、seq?id?no:19所示的正向引物與seq?id?no:20所示的反向引物、seq?id?no:21所示的正向引物與seq?id?no:22所示的反向引物、seq?id?no:23所示的正向引物與seq?id?no:24所示的反向引物、seq?id?no:25所示的正向引物與seq?id?no:26所示的反向引物、seq?id?no:27所示的正向引物與seq?id?no:28所示的反向引物、seq?idno:29所示的正向引物與seq?id?no:30所示的反向引物，以上15個引物對中的至少一對。

9、優(yōu)選地，步驟(2)設計的接頭序列和步驟(3)用于擴增探針模板庫的引物為seq?idno:21所示的正向引物與seq?id?no:22所示的反向引物。

10、本發(fā)明探究了不同的接頭序列(4對)對探針結合效率的影響，發(fā)現(xiàn)接頭的序列會影響探針與靶位點的結合效率，可能是因為接頭序列本身或接頭序列與特異性結合靶區(qū)域的序列形成二級結構，從而影響探針與靶區(qū)域空間上的結合，而含由seq?id?no:21所示的正向引物與seq?id?no:22所示的反向引物組成的引物對11的探針雜交效率最高。

11、進一步地，步驟(1)所述her2基因探針靶點區(qū)域始于her2基因5’端的bv105677，至基因3’端末端的rh75294，覆蓋區(qū)域約為400kb；cen17位點包含人類的17號染色體的著絲粒區(qū)間。

12、利用生物信息學手段，針對所述her2基因/cen17位點探針靶點區(qū)域分別設計了4,277條和17條特異性結合的核苷酸片段(不含接頭)，長度均為101bp。

13、進一步地，步驟(3)中pcr擴增采用的dna聚合酶為phanta?ax?super-fidelitydna?polymerase。

14、本發(fā)明用3種不同的高保真酶(kapa?hifi、tianseq?hifi?amplification?mi和phanta?ax?super-fidelity?dna?polymerase)對探針進行擴增，并用fish實驗來檢驗不同的酶的擴增的最終效果。實驗結果表明，上述三種酶皆可用于擴增用于檢測her2基因數(shù)目的fish探針，但phanta?ax?super-fidelity?dna?polymerase的效果最佳。

15、.進一步地，步驟(1)中所述重復序列包含tttt、aaaa的寡核苷酸序列；步驟(2)中所述寡核苷酸序列為121bp。

16、進一步地，步驟(3)中靶向her2基因區(qū)域的探針被綠色熒光染料fluorescein標記，而橘紅色熒光染料atto-1標記靶向cen17區(qū)域的探針。

17、本發(fā)明探究了不同熒光染料(3種橙色染料和2種綠色染料)之間交叉組合標記fish探針的檢測效果，發(fā)現(xiàn)熒光染料fluorescein和atto-1組合標記的效果最佳。

18、進一步地，所述熒光染料fluorescein和atto-1的使用濃度范圍分為0.005-0.1mm和0.005-0.1mm，其中，最佳的使用濃度分別為0.05mm和0.01mm。

19、另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測her2基因擴增的新型fish探針，所述探針由上述方法制備，所述fish探針中還包含雜交液和染色液。

20、另一方面，本發(fā)明提供了一種特異性擴增引物在檢測her2基因擴增熒光原位雜交探針制備中提高所獲得的探針靶標后熒光效果的用途，所述特異性擴增引物對序列為seqid?no:21所示的正向引物與seq?id?no:22所示的反向引物。

21、另一方面，本發(fā)明提供了一種oligo法在檢測her2基因擴增熒光原位雜交探針制備中提高所獲得的探針靶標后熒光效果的用途。

22、本發(fā)明對oligo法和bac克隆法制備的檢測her2基因拷貝數(shù)探針進行了比較，發(fā)現(xiàn)這兩種方法制備的fish探針基本都能進入到每一個細胞中，并與her2基因特異性結合，但與bac制備的探針相比，oligo法制備的fish探針發(fā)出的熒光更強，發(fā)光區(qū)域更大，熒光界限更清晰，總之，更容易計算得到her2基因的拷貝數(shù)，以達診斷乳腺癌的目的。

23、本發(fā)明的有益效果包括：

24、1、因在設計探針時已經剔除了重復序列和非特異性序列，本發(fā)明制備的熒光原位雜交探針特異性高、使用時信號點明亮清晰、背景低且清晰無雜點，檢測精度比原始bac克隆探針的高，且無需添加cot?1dna進行封閉；

25、2、本發(fā)明提供的檢測her2基因擴增探針的制備方法不受bac克隆限制，且只需要化學合成一次，不僅降低了合成的成本，還能減少因反復合成造成的批次差異；

26、3、構建的寡核苷酸探針模板庫儲存方便，且能長期保存；制備探針的工藝簡單，能夠在短時間內制備大量探針，適于規(guī)模化生產；

27、4、常用的細菌人工染色體bac克隆和聚合酶鏈式反應pcr(隨機引物法)制備出來的探針大小都是隨機的，具有不可控性，一般長度在100-1,500bp之間，而本發(fā)明制備的fish探針大小均一可控，大小在60-240bp之間。核苷酸序列越短，穿透能力越強，能夠比較輕松地穿透細胞核膜，從而提高雜交效率，在熒光顯微鏡下的熒光信號強度越高；

28、5、本發(fā)明除了對引物序列進行篩選，還通過對擴增寡核苷酸的dna聚合酶、探針染料及其濃度進行優(yōu)化，優(yōu)選出最適宜制備用于檢測her2基因擴增的fish探針制備方案，所制備的熒光雜交探針在熒光顯微鏡下信號更強，便于觀察，且重復測試效果穩(wěn)定，適用于長期生產大量探針。

29、6、本發(fā)明提供的探針可用于體外定性檢測經10％中性福爾馬林固定石蠟包埋乳腺癌組織切片中her2基因的拷貝數(shù)，從而達到快速精確診斷乳腺癌的目的。

30、7、本發(fā)明利用先進技術來優(yōu)化生產工藝，從而降低產品成本，提高產品的市場競爭力。