本發(fā)明涉及細(xì)胞工程，具體涉及一種胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、胃癌發(fā)生率很高，威脅國(guó)民健康，尤其是侵襲性的，為了能更好的探究出胃癌是如何原位侵襲并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的，本領(lǐng)域急需尋找一種技術(shù)方案可以在體外成功模擬出胃癌發(fā)展的第一步—原位侵襲。目前與腫瘤類器官共培養(yǎng)方案為兩種：正常類器官與腫瘤類器官共培養(yǎng)、正常細(xì)胞與腫瘤類器官共培養(yǎng)。

2、正常類器官與腫瘤類器官共培養(yǎng)方案：（1）將兩種類器官消化成單細(xì)胞，這破壞了類器官的結(jié)構(gòu)，不能發(fā)揮類器官模擬體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)。本專利考慮到此問題，并未將功能性人類胃腸道類器官與胃癌類器官消化成單細(xì)胞。（2）兩種類器官按1:1細(xì)胞數(shù)目比例混合，未能按體內(nèi)實(shí)際比例混合，不能很好模擬體內(nèi)情況。本專利考慮到此問題，將胃癌類器官注射至功能性人類胃腸道類器官的胃黏膜層空腔中，模擬了體內(nèi)胃癌浸潤(rùn)黏膜及肌層過程，為了解胃癌進(jìn)展機(jī)制及發(fā)現(xiàn)靶向治療提供理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

3、正常細(xì)胞與腫瘤類器官共培養(yǎng)方案：（1）簡(jiǎn)單地把胃正常細(xì)胞與胃癌類器官共培養(yǎng)，并不能在體外模擬胃生理結(jié)構(gòu)與環(huán)境，由此不能達(dá)到模擬體內(nèi)胃癌浸潤(rùn)目的。

4、因此，現(xiàn)在亟需構(gòu)建能模擬胃結(jié)構(gòu)與功能的功能性人類胃腸道類器官，將其與胃癌類器官共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)胃癌浸潤(rùn)黏膜及肌層過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明公開了一種胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法，構(gòu)建了一種模擬胃癌在胃黏膜及肌層浸潤(rùn)生長(zhǎng)的體外類器官模型，為了解胃癌進(jìn)展機(jī)制及發(fā)現(xiàn)靶向治療提供理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

3、本發(fā)明公開了一種胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

4、步驟1.?胃癌類器官培養(yǎng)；

5、步驟2.?功能性人類胃腸道類器官培養(yǎng)；

6、步驟3.?胃癌類器官和功能性人類胃腸道類器官共同培養(yǎng)：

7、（1）收集步驟1所得的成熟的胃癌類器官，用類器官專用解離劑消化，離心，棄膠，以1×104個(gè)/ml的密度重懸于dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；

8、（2）將步驟2得到的功能性人類胃腸道類器官接種在膠滴中，置于37℃孵箱中10min；

9、（3）在無菌工作臺(tái)內(nèi)，用內(nèi)徑大于0.1mm的玻璃顯微注射針吸取步驟2中胃癌類器官懸液，將其加載到顯微注射設(shè)備上；

10、（4）在立體顯微鏡下將（3）吸取的胃癌類器官懸液注射至（2）所得的功能性人類胃腸道類器官的黏膜層一側(cè)的空腔中，并加入共培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，每3天更換。

11、進(jìn)一步地，步驟3（1）所述解離劑消化時(shí)間為4min，然后離心，得不含基質(zhì)膠的完整胃癌類器官。

12、進(jìn)一步地，步驟3（2）功能性人類胃腸道類器官接種比例為1:6。

13、進(jìn)一步地，步驟3（4）所述共培養(yǎng)專用培養(yǎng)基組分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、谷氨酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、原代細(xì)胞抗生素、血清添加劑b27、血清添加劑n2、表皮生長(zhǎng)因子、wnt-3a重組蛋白、r-spondin1重組蛋白、頭蛋白、rock抑制劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10、胃泌素i、tgfβ抑制劑和糖原合成酶激酶3抑制劑；

14、所述共培養(yǎng)專用培養(yǎng)基的總體積計(jì)：1x基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2?mm谷氨酰胺、13mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、50μg/ml原代細(xì)胞抗生素、50x血清添加劑b27、100x血清添加劑n2、100ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、100ng/ml?wnt-3a重組蛋白、1μg/ml?r-spondin1重組蛋白、100ng/ml頭蛋白、10μmrock抑制劑、200ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10、10nm胃泌素i、2μm?tgfβ抑制劑和2μm糖原合成酶激酶3抑制劑。

15、本發(fā)明還公開了一種模擬胃癌在胃黏膜及肌層浸潤(rùn)生長(zhǎng)的體外類器官模型，其特征在于，通過如上任一項(xiàng)所述胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)方法構(gòu)建得到。

16、本發(fā)明還公開了一種胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)模型，其特征在于，通過如上任一項(xiàng)所述胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)方法構(gòu)建得到。

17、本發(fā)明還公開了一種根據(jù)上述所述的模擬胃癌在胃黏膜及肌層浸潤(rùn)生長(zhǎng)的體外類器官模型或上述所述的胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)模型在研究胃癌侵襲胃黏膜及肌層過程及相關(guān)機(jī)制方面的應(yīng)用。

18、本發(fā)明還公開了一種胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)培養(yǎng)基，其特征在于，所述共培養(yǎng)專用培養(yǎng)基組分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、谷氨酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、原代細(xì)胞抗生素、血清添加劑b27、血清添加劑n2、表皮生長(zhǎng)因子、wnt-3a重組蛋白、r-spondin1重組蛋白、頭蛋白、rock抑制劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10、胃泌素i、tgfβ抑制劑和糖原合成酶激酶3抑制劑；

19、所述共培養(yǎng)專用培養(yǎng)基的總體積計(jì)：1x基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2mm谷氨酰胺、13mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、50μg/ml原代細(xì)胞抗生素、50x血清添加劑b27、100x血清添加劑n2、100ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、100ng/ml?wnt-3a重組蛋白、1μg/ml?r-spondin1重組蛋白、100ng/ml頭蛋白、10μmrock抑制劑、200ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10、10nm胃泌素i、2μm?tgfβ抑制劑和2μm糖原合成酶激酶3抑制劑。

20、進(jìn)一步地，上述任一項(xiàng)所述的胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)培養(yǎng)基在構(gòu)建胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)模型中的應(yīng)用。

21、進(jìn)一步地，上述任一項(xiàng)所述的胃癌類器官與功能性人類胃腸道類器官共培養(yǎng)培養(yǎng)基在構(gòu)建模擬胃癌在胃黏膜及肌層浸潤(rùn)生長(zhǎng)的體外類器官模型中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明首次提出先分別制備胃癌類器官及功能性人類胃腸道類器官。然后對(duì)胃癌類器官進(jìn)行g(shù)fp轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定株。之后，收集成熟并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌類器官，用類器官專用解離劑消化4min后離心，以1×104個(gè)/ml的密度重懸于dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。將功能性人類胃腸道類器官按1:6接種在新的50μl膠滴中，并置于37℃孵箱中10min。在無菌工作臺(tái)內(nèi)，用內(nèi)徑大于0.1mm的玻璃顯微注射針吸出約5μl胃癌類器官懸液，并加載到顯微注射設(shè)備上。在立體顯微鏡下，將胃癌類器官懸液注射至每個(gè)成熟的功能性人類胃腸道類器官的空腔中，加入共培養(yǎng)專用培養(yǎng)基，并每3天更換一次。注射后24h，利用熒光顯微鏡驗(yàn)證胃癌類器官在功能性人類胃腸道類器官中的存活情況，隨后利用共聚焦顯微鏡觀察胃癌類器官的生長(zhǎng)及其對(duì)功能性人類胃腸道類器官的侵襲行為。共培養(yǎng)類器官進(jìn)行石蠟包埋切片后，利用共聚焦顯微鏡確定侵襲區(qū)域，用fiji軟件中的roi功能測(cè)量侵襲區(qū)域面積，再用細(xì)胞計(jì)數(shù)功能對(duì)gfp+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而得出共培養(yǎng)模型中g(shù)fp+細(xì)胞數(shù)量及密度。

23、與現(xiàn)有技術(shù)比，本發(fā)明的有益效果如下。

24、本發(fā)明公開了一種模擬胃癌在胃黏膜及肌層浸潤(rùn)生長(zhǎng)的體外類器官模型，為了解胃癌進(jìn)展機(jī)制及發(fā)現(xiàn)靶向治療提供理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

25、本發(fā)明所公開的構(gòu)建方法，縮短類器官解離劑消化時(shí)間，僅分離基質(zhì)膠和類器官，未將胃癌類器官和功能性人類胃腸道類器官消化成單細(xì)胞，保留類器官3d結(jié)構(gòu)，發(fā)揮類器官模擬機(jī)體的優(yōu)勢(shì)。

26、現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單地把胃正常細(xì)胞與胃癌類器官共培養(yǎng)，并不能在體外模擬胃生理結(jié)構(gòu)與環(huán)境，由此不能達(dá)到模擬體內(nèi)胃癌浸潤(rùn)目的。本發(fā)明考慮到空間位置關(guān)系，通過顯微注射設(shè)備將胃癌類器官注射至功能性人類胃腸道類器官的黏膜層一側(cè)的空腔中，模擬了胃癌浸潤(rùn)肌層這一過程。