本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物和基因治療領(lǐng)域，具體涉及一種尤其涉及治療惡性腫瘤相關(guān)疾病的藥物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傳統(tǒng)的腫瘤治療方式包括外科手術(shù)治療、放療和化療等，為當(dāng)前治療惡性腫瘤的主要手段。外科手術(shù)治療對良性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤的長期控制有一定療效，但對許多晚期轉(zhuǎn)移性腫瘤的長期療效卻不夠理想。雖然可以切除腫瘤，但是手術(shù)過程中可能無法完全切除或引起腫瘤轉(zhuǎn)移，對患者機(jī)體傷害較大，可能造成器官損傷及機(jī)體免疫力降低。放療在某些腫瘤可以達(dá)到手術(shù)切除的效果，但放療成本高，周期長，并發(fā)癥也較多。化療作為一種全身性的治療，效果明顯和迅速，但在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也可能會把正常細(xì)胞一起殺滅，產(chǎn)生全身性的副作用。目前的癌癥常規(guī)治療手段對降低癌癥的年死亡率影響不大。尤其對于晚期患者常規(guī)治療方法在延長生存期或提高患者生存質(zhì)量方面幾乎未見療效。不僅大部分惡性轉(zhuǎn)移癌癥的治愈率很低，而且這些常規(guī)治療還經(jīng)常使病情加重。

2、溶瘤病毒(溶瘤病毒)是一種新型的癌癥免疫治療藥物。溶瘤病毒是一種經(jīng)過基因改造的病毒，可以選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并破壞腫瘤細(xì)胞，而不會對正常細(xì)胞造成傷害。溶瘤病毒的生物擴(kuò)增是其相對于其它癌癥治療方法的主要優(yōu)勢。溶瘤病毒通過兩方面發(fā)揮作用：1.溶瘤病毒直接感染腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，造成它們的裂解。2.招募免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞中溶瘤病毒的生物擴(kuò)增是溶瘤病毒治療相對于其他癌癥治療的主要優(yōu)勢之一。與傳統(tǒng)免疫療法相比，溶瘤病毒有許多優(yōu)勢，包括靶向準(zhǔn)確、殺傷高效和不良反應(yīng)小。

3、bite是一種雙特異性抗體，由兩段單鏈抗體片段(scfv)組成，一端靶向腫瘤相關(guān)抗原，另一端靶向t細(xì)胞受體復(fù)合物的不變成分cd3。靶向這兩個靶點(diǎn)使bite同時結(jié)合t細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，同時介導(dǎo)t細(xì)胞殺傷被識別的腫瘤細(xì)胞。bite的結(jié)構(gòu)完全來自于親代抗體的可變區(qū)，相對于完整抗體，它體積小(約55kda)，其各區(qū)域間在空間位置上非常靈活。因此其能夠使t細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞密切接觸，同時結(jié)合其兩個靶點(diǎn)。bite不存在抗體的恒定區(qū)，尤其是fc段，不僅有藥代動力學(xué)意義，還可避免出現(xiàn)與fc受體結(jié)合所引起的相關(guān)藥物毒性。然而，bite在腫瘤微環(huán)境中的生物半衰期較短，在腫瘤中停留時間短，需要頻繁給藥，限制了其在臨床中的應(yīng)用。

4、b7h3是一種i型跨膜蛋白，屬于b7家族中的一個成員，具有免疫調(diào)節(jié)功能。b7h3在正常人體組織中缺失或低表達(dá)，但在人類惡性腫瘤中高表達(dá)。b7h3的表達(dá)通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和惡性行為，并且與不良預(yù)后相關(guān)。近年來，b7h3被認(rèn)為是未來免疫治療的一個很有前景的靶點(diǎn)，目前已經(jīng)開發(fā)了幾種針對b7h3的治療性抗體，但仍需全身給藥，給藥量大，給藥次數(shù)多，風(fēng)險較大，仍需一種有效地在腫瘤原位遞送抗體的方式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，為了增強(qiáng)溶瘤病毒的抗腫瘤能力，我們發(fā)明了一種b7h3?bite，及其編碼基因片段。

2、本發(fā)明的另一目的是提供編碼b7h3?bite的溶瘤病毒。該溶瘤病毒能夠在腫瘤中表達(dá)b7h3?bite。b7h3?bite同時靶向腫瘤細(xì)胞表面的b7h3和t細(xì)胞表面的cd3，連接腫瘤細(xì)胞和t細(xì)胞，介導(dǎo)t細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，從而提升溶瘤病毒的抗腫瘤能力。

3、本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種靶向b7h3的雙特異性t細(xì)胞銜接器b7h3-bite，所述的b7h3-bite具有如下結(jié)構(gòu)：

5、分泌信號肽-vh(cd3)-連接子1-vl(cd3)-連接子2-vh(b7h3)-連接子3-vl(b7h3)；所述的b7h3-bite的氨基酸序列如seq?id?no：3所示。

6、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的b7h3-bite的編碼核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

7、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述bite同時靶向t細(xì)胞cd3抗原和腫瘤相關(guān)性抗原b7h3。

8、所述b7h3-bite中包含人b7h3抗體序列片段和cd3的兩個scfv序列。

9、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，b7h3和cd3的兩段scfv序列以編碼g4s接頭的dna序列連接。

10、編碼所述的雙特異性t細(xì)胞銜接器b7h3-bite的基因片段，b7h3-bite結(jié)構(gòu)中，分泌信號肽的編碼核苷酸序列如seq?id?no：1所示，vh(cd3)的編碼核苷酸序列如seq?id?no：4所示，vl(cd3)的編碼核苷酸序列如seq?id?no：5所示，vh(b7h3)的編碼核苷酸序列如seqid?no：6所示，vl(b7h3)的編碼核苷酸序列如seq?id?no：7所示；連接子1、連接子2或連接子3為一組g4s連接子或多組g4s連接子的串聯(lián)；連接子1的核苷酸序列如seq?id?no：8所示，連接子2的核苷酸序列如seq?id?no：9所示，連接子3的核苷酸序列如seq?id?no：10所示。

11、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的b7h3-bite的編碼核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

12、本發(fā)明所述的基因片段在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備治療腫瘤的溶瘤病毒中的應(yīng)用，進(jìn)一步優(yōu)選在制備治療b7h3陽性實(shí)體瘤的溶瘤病毒中的應(yīng)用。

13、所述的b7h3陽性實(shí)體瘤優(yōu)選滑膜肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、間皮組織腫瘤、腎母細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)煦癌、腎細(xì)胞癌、橫紋肌肉瘤。

14、一種重組溶瘤腺病毒，表達(dá)所述的雙特異性t細(xì)胞銜接器b7h3-bite。

15、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，其基因組中包含權(quán)利要求3～4中任一項所述的基因片段。

16、本發(fā)明采用htert啟動子啟動病毒復(fù)制必須基因e1a的表達(dá)，以使病毒選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制而不在正常細(xì)胞中復(fù)制。將b7h3?bite序列置于mcmv啟動子之后以啟動b7h3?bite的表達(dá)。在b7h3?bite之前加入分泌信號肽以增強(qiáng)其分泌。

17、在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種重組溶瘤腺病毒，該病毒基于5型腺病毒構(gòu)建，其基因組中包含編碼bite抗體或抗體片段的核苷酸序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述重組溶瘤腺病毒的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所使用的病毒為5型腺病毒，采用ad-max系統(tǒng)包裝病毒。

19、本發(fā)明所述的重組溶瘤腺病毒在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備治療b7h3陽性實(shí)體瘤的藥物中的應(yīng)用。

20、所述的b7h3陽性實(shí)體瘤優(yōu)選滑膜肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、間皮組織腫瘤、腎母細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)煦癌、腎細(xì)胞癌、橫紋肌肉瘤。

21、在本發(fā)明的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組溶瘤腺病毒rcad-b7h3-bite對于b7h3陽性癌細(xì)胞具有良好的殺傷作用，例如對u87、mgc-803在內(nèi)的多種腫瘤具有良好的溶瘤效力，并且在pbmcs的存在下可顯著提升殺傷能力。

22、一種治療b7h3陽性實(shí)體瘤的藥物組合物，以所述的重組溶瘤腺病毒為有效成分。

23、本發(fā)明提供了一種治療實(shí)體瘤的方法，其包括向受試者施用治療有效量的上述第一方面中所述的重組溶瘤腺病毒或包含本發(fā)明所述重組溶瘤腺病毒的組合物或藥物制劑。

24、其中，所述“受試者”是指已經(jīng)是治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對象的動物，優(yōu)選指哺乳動物，最優(yōu)選指人。所述“治療有效量”是指包括本發(fā)明化合物在內(nèi)的活性化合物或藥劑的量，該量可引起研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他醫(yī)療人員所追求的組織系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)響應(yīng)，這包括減輕或部分減輕受治療的疾病、綜合征、病癥或障礙的癥狀。

25、本發(fā)明的化合物和藥物組合物可對哺乳動物臨床使用，包括人和動物個體的最佳劑量應(yīng)依據(jù)具體的治療而定。通常情況下是從小劑量開始，逐漸增加劑量一直到找到最適合的劑量。

26、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：本發(fā)明提供了一種重組溶瘤腺病毒，該腺病毒可以表達(dá)并分泌一種雙特異性抗體，尤其是b7h3?bite，其能夠橋接腫瘤細(xì)胞和t細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫突觸形成，介導(dǎo)t細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。尤其是，經(jīng)修飾后獲得的rcad-b7h3-bite，其能同時靶向t細(xì)胞cd3抗原和腫瘤細(xì)胞b7h3抗原，既增強(qiáng)了溶瘤腺病毒的靶向性、同時避免了bite全身用藥引起的不良反應(yīng)，增加了溶瘤腺病毒對實(shí)體瘤的殺傷效果。