本發(fā)明涉及基因工程，具體是一株基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著工業(yè)化不斷發(fā)展，世界對(duì)石油這一戰(zhàn)略性資源的需求日益增加。但由于石油在井噴、運(yùn)輸、儲(chǔ)存及加工過(guò)程中的泄露，產(chǎn)生了大規(guī)模的石油污染土壤。我國(guó)油田所產(chǎn)原油大多為含石蠟原油，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有90%原油的石蠟含量達(dá)到了20%~40%。石蠟主要是由碳鏈長(zhǎng)度為18~30的長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴組成，原油泄露后將導(dǎo)致土壤中的長(zhǎng)鏈烷烴含量較高，而長(zhǎng)鏈烷烴在土壤中不易回收，將造成土壤污染。因此，提高長(zhǎng)鏈烷烴的降解效率在修復(fù)石油污染土壤過(guò)程中尤為重要。

2、目前發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈烷烴降解酶主要有alkb、cyp153、alma和lada，自從throne-holst等通過(guò)基因敲除及基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了alma的編碼基因 alma參與了c32及更長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴降解后（throne-holst?m,?wentzel?a,?ellingsen?te,?et?al.?identification?ofnovel?genes?involved?in?long-chain?nalkane?degradation?by acinetobactersp.strain?dsm?17874?[j].?applied?microbiology?and?biotechnology,?2007,?73:?3327–3332.）， alma便被作為長(zhǎng)鏈烷烴降解中的代表性基因得到廣泛研究，通常認(rèn)為其是一種烷烴羥化酶的編碼基因，參與了長(zhǎng)鏈烷烴的末端羥基化過(guò)程（wentzel?a,?ellingsen?te,kotlar?h-k,?et?al.?bacterial?metabolism?of?long-chain?n-alkanes[j].?appliedmicrobiology?and?biotechnolog,?2007,?76:?1209–1221.）。wang等通過(guò)異源表達(dá)和q-pcr技術(shù)手段證明了 alcanivorax?hongdengensisa-11-3中的 alma編碼了一種烷烴羥化酶，可參與長(zhǎng)鏈烷烴的末端羥基化過(guò)程（wang?wp,?shao?zz.?genes?involved?in?alkanedegradation?in?the alcanivorax?hongdengensisstrain?a-11-3?[j].?appliedmicrobiology?and?biotechnology,?2012,94:437–448.）。li等人對(duì) pseudomonas? aeruginosadn1中的分解代謝基因的表達(dá)情況及降解底物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn) alma僅在c20以上的烷烴中其mrna水平顯著增加，其中底物為c32時(shí)增幅最大；分別敲除 alma1及 alma2后，菌株在鏈長(zhǎng)長(zhǎng)于32的烷烴上生長(zhǎng)受到了抑制，證明 alma1及 alma2編碼了一種烷烴羥化酶，可參與c32及更長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴降解（li?yp,?pan?jc,?ma?yl.?elucidation?of?multiplealkane?hydroxylase?systems?in?biodegradation?of?crude?oil?n-alkane?pollutionby pseudomonas?aeruginosadn1?[j].?journal?of?applied?microbiology,?2019,128:151-160.）。

3、活不動(dòng)桿菌（ acinetobacter?vivianii）kj-1是從齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）彩石校區(qū)附近某加油站周圍的汽油、柴油污染土壤分離出的一株正十二烷降解菌，具有較強(qiáng)的柴油降解能力。目前，活不動(dòng)桿菌kj-1已經(jīng)完成了全基因組測(cè)序，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在 av-alma基因。 av-alma基因與現(xiàn)有的 alma基因具有序列相似性，但不同屬間的alma可能具有獨(dú)特的進(jìn)化起源和不同的功能。因此，本發(fā)明擬探究 av-alma基因的具體功能，為其今后的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4、目前，常將目的基因?qū)胧荏w菌中構(gòu)建基因工程菌來(lái)研究目的基因的功能。部分受體菌為野生型細(xì)菌，在進(jìn)行分子生物學(xué)操作時(shí)不同于模式大腸桿菌，常規(guī)的熱激轉(zhuǎn)化法可能無(wú)法滿足構(gòu)建工程菌的要求，并且大量開發(fā)的適用于模式大腸桿菌的表達(dá)載體可能不適用于野生型細(xì)菌?？紤]到構(gòu)建的基因工程菌需要具備較好的生態(tài)安全性及穩(wěn)定性，且防止表達(dá)載體在細(xì)菌傳代過(guò)程中丟失從而造成環(huán)境污染，這就對(duì)轉(zhuǎn)化方法及載體的選擇提出了更高的要求。

5、三親接合轉(zhuǎn)化法是通過(guò)供體菌、受體菌、輔助菌間的直接接觸，利用載體間的接合轉(zhuǎn)移功能，使得供體菌中含有目的基因的重組轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)移至受體菌中。put/mini-tn5km轉(zhuǎn)座子載體具有將目的基因整合至受體基因組的功能，該載體具有的orir6k復(fù)制子僅在含有由pir基因產(chǎn)生的π蛋白的情況下才可以復(fù)制，當(dāng)含有目的基因的重組轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)入受體菌后，由于受體菌不能產(chǎn)生π蛋白，失去了目的基因的載體將由于不能自身復(fù)制則會(huì)隨著受體菌的不斷增殖最終在受體菌中消失。三親接合轉(zhuǎn)化法不再需要額外添加抗生素，且杜絕了表達(dá)載體進(jìn)入自然環(huán)境后所造成的污染，保證了基因工程的穩(wěn)定性及安全性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一株基因工程菌，使用質(zhì)粒put/mini-tn5?km作為轉(zhuǎn)座子載體，通過(guò)三親接合轉(zhuǎn)化法將 av-alma基因?qū)氲揭宜徕}不動(dòng)桿菌（ acinetobacter?calcoaceticus）21#（保藏編號(hào)cgmcc?no.31080）中，成功獲得了一株石油烴降解基因工程菌，該基因工程菌對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴正二十八烷、脂肪酮2-癸酮和2-十二酮表現(xiàn)出了較高的降解活性，在修復(fù)石油污染土壤方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明技術(shù)方案如下：

3、一株基因工程菌，是一株表達(dá)氨基酸序列如seq?id?no.2所示的 av-alma酶的重組乙酸鈣不動(dòng)桿菌（ acinetobacter?calcoaceticus）21#。

4、所述基因工程菌的構(gòu)建方法，是將 av-alma基因?qū)氲揭宜徕}不動(dòng)桿菌21#中獲得，所述 av-alma基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述乙酸鈣不動(dòng)桿菌21#的保藏編號(hào)cgmcc?no.31080。

5、優(yōu)選的，所述導(dǎo)入的方法為，使用轉(zhuǎn)座子載體，通過(guò)三親接合轉(zhuǎn)化法將 av-alma基因?qū)氲揭宜徕}不動(dòng)桿菌21#中。

6、優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)座子載體為質(zhì)粒put/mini-tn5?km。

7、優(yōu)選的，所述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

8、（1）擴(kuò)增目的基因 av-alma；

9、（2）構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒；

10、（3）將重組質(zhì)粒中的目的基因與轉(zhuǎn)座子載體連接，構(gòu)建含有目的基因的重組轉(zhuǎn)座子載體；

11、（4）通過(guò)三親接合轉(zhuǎn)化法將重組轉(zhuǎn)座子載體導(dǎo)入到乙酸鈣不動(dòng)桿菌21#中。

12、所述基因工程菌在降解長(zhǎng)鏈烷烴、降解脂肪酮中的應(yīng)用。

13、優(yōu)選的，所述長(zhǎng)鏈烷烴為正二十八烷。

14、優(yōu)選的，所述脂肪酮為2-癸酮、2-十二酮。

15、所述基因工程菌在修復(fù)石油污染土壤中的應(yīng)用。

16、優(yōu)選的，所述石油污染土壤中包括烷烴、芳香烴、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)。

17、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述石油污染土壤中的石油濃度為1~5%（w/w）。

18、有益效果：

19、本發(fā)明使用質(zhì)粒put/mini-tn5?km作為轉(zhuǎn)座子載體，通過(guò)三親接合轉(zhuǎn)化法將 av- alma基因?qū)氲揭宜徕}不動(dòng)桿菌21#（保藏編號(hào)cgmcc?no.31080）中，成功獲得了一株石油烴降解基因工程菌，該基因工程菌對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴正二十八烷、脂肪酮2-癸酮和2-十二酮表現(xiàn)出了較高的降解活性，在修復(fù)石油污染土壤方面具有廣闊的應(yīng)用前景。